2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
- Mẫu cây Co chuông hôm bao gồm cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản với cách xử lý mẫu như sau:
+ Làm mẫu tiêu bản khô để gửi giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Phòng tiêu bản cây thuốc-Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) [5].
+ Cành và lá bảo quản trong Ethanol 50% để làm tiêu bản vi phẫu. + Nơi thu mẫu: Huyện Điện Biên-Tỉnh Điện Biên.
+ Thời gian thu mẫu: Tháng 3 năm 2014.
Nghiên cứu hàm lượng và thành phần tinh dầu
- Gỗ rễ, gỗ thân, lá của cây Co chuông hôm khoảng 20 năm tuổi, phơi khô, cắt hay nghiền nhỏ bảo quản trong túi nylon để xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu.
+ Nơi thu mẫu: Huyện Điện Biên-Tỉnh Điện Biên. + Thời gian thu mẫu: Tháng 3 năm 2014.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Dung môi, hóa chất
- Javen, Acid acetic, xanh Methylen, đỏ son phèn, Glycerin, Diethyl ether, Natri sunfat khan, nước cất, Xylen, khí Heli, Chloroform, Silica gel.
Thiết bị nghiên cứu
- Kính hiển vi Leica, kính lúp soi nổi Leica, máy ảnh Cannon IXY 30S, tủ sấy Shellad, kim mũi mác, chổi lông, phiến kính, lamen, bình gạn,
cốc có mỏ, buret chính xác 0,05ml, bếp điện, cân kĩ thuật, dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, găng tay cao su, túi nylon, bao tải, kéo cắt cây, chai nhựa, nhãn đeo, sổ ghi chép thực địa, bút chì, cặp ép cây, bìa cứng, kim chỉ, nhãn tiêu bản, đĩa petri, kim phân tích, panh kẹp, dao lam.
- Bộ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước (bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger) của Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Bộ định lượng tinh dầu nặng hơn nước của Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Hệ thống GC: Agilent Technologies 7890A, hệ thống MS: Agilent Technologies 5975C, Cột sắc kí DB-WAX.
2.2. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật
Quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi nổi và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [5].
Nghiên cứu về cấu tạo giải phẫu
Sử dụng phương pháp nhuộm kép, quan sát trên kính hiển vi và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [5].
Từ các đặc điểm thực vật này so sánh với các tài liệu mô tả và các khóa phân loại thực vật để xác định tên khoa học của cây.
2.2.2. Nghiên cứu hàm lƣợng và thành phần tinh dầu
Định lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây
- Định lượng tinh dầu trong gỗ rễ và gỗ thân:
Rễ và thân cây sau khi được loại bỏ vỏ ngoài, làm sạch phơi khô cắt và nghiền nhỏ, rây qua rây 2000, phần mẫu qua rây được đem cất định lượng bằng bộ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước, theo phương pháp cất kéo hơi nước trong 4 giờ, sau đó ngắt nguồn nhiệt để cho bộ cất trở về nhiệt độ phòng,
toàn bộ dịch cất trong ống gạn được đưa qua 1 buret chính xác tới 0,05ml chứa sẵn một thể tích xác định Xylen đã được bão hòa nước a1 (ml), đọc và ghi lại thể tích của hỗn hợp tinh dầu và Xylen a2 (ml) trong buret.
Song song tiến hành xác định hàm ẩm của mẫu bằng phương pháp cất với dung môi [6], [3]. Sử dụng bộ định lượng tinh dầu nặng hơn nước với dung môi Xylen.
Hàm lượng tinh dầu trong mẫu khô tuyệt đối được xác định theo công thức:
X1
Trong đó a1: Thể tích Xylen được bão hòa nước ban đầu (ml)
a2: Thể tích hỗn hợp tinh dầu và Xylen (ml)
m: Khối lượng nguyên liệu (g) H: Hàm ẩm dược liệu (%) X1: Hàm lượng tinh dầu (%) - Định lượng tinh dầu trong lá:
Nguyên liệu khô được cắt nhỏ, cất định lượng bằng bộ cất tinh dầu nhẹ hơn nước, theo phương pháp cất kéo hơi nước trong 2 giờ 30 phút, sau khi cất để nguội bộ cất tới nhiệt độ phòng, sử dụng Diethyl ether để tách lấy tinh dầu, làm khan bằng Natri sunfat khan, bay hơi Diethyl ether và cân xác định khối lượng tinh dầu a (g).
Song song tiến hành xác định hàm ẩm của mẫu bằng phương pháp cất với dung môi [6], [3]. Sử dụng bộ định lượng tinh dầu nặng hơn nước với dung môi Xylen.
Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu mẫu lá khô tuyệt đối được xác định theo công thức: X2
Trong đó
a: Khối lượng tinh dầu (g)
m: Khối lượng nguyên liệu (g) H: Hàm ẩm dược liệu (%) X2:Hàm lượng tinh dầu (%)
Xác định thành phần tinh dầu
Phân tích thành phần tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ (GC/MS) tại Bộ môn Dược liệu-Trường Đại học Dược Hà Nội với chương trình khai triển như sau:
- Mẫu tinh dầu được pha loãng 100 lần bằng dung môi Chloroform. - Tiêm mẫu tự động.
- Thể tích tiêm mẫu 1µl, chia dòng 1:50.
- Sử dụng khí mang Heli, tốc độ khí mang 1ml/phút. - Chương trình nhiệt độ:
Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ sử dụng trong GC/MC phân tích tinh dầu
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)
Cột
0-5 60
5-33 60→200
33-38 200
Nhiệt độ hóa hơi mẫu 250
- Detector: MS.
Phổ được so sánh với các phổ chuẩn của thư viện Wiley, Flavor và Nist để đưa ra kết quả.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Đặc điểm thực vật cây Co chuông hôm
Đặc điểm hình thái
Mẫu cây Co chuông hôm thu tại Điện Biên có đặc điểm hình thái đặc trưng của họ Long não (Lauraceae) và chi Cinnamomum, đặc điểm của cây
được mô tả như sau:
Cây gỗ, thường xanh; các bộ phận của cây có mùi thơm và chứa tinh dầu, cao 7-10m hoặc hơn. Thân tiết diện gần tròn, đường kính 20-35cm có thể lên tới 80cm, vỏ thân nứt dọc, kẽ nứt màu đỏ. Cành non màu xanh, nhẵn. Lá đơn, so le, nhẵn; cuống lá hình trụ, xanh nhạt, có rãnh ở mặt trên, dài 1,5- 3cm; phiến lá hình trứng, đôi khi thấy nhọn ở đầu, nhẵn, dài 6-16cm, rộng 4- 10cm; mặt trên sáng bóng, màu xanh đậm, mặt dưới lá xanh nhạt hơn; mép nguyên; gân lá hình lông chim, 5-7 cặp gân, gốc mỗi gân có có 1 tuyến rõ, gân cấp 2 hình mạng.
Cụm hoa chùy, mọc ở nách lá hay ngọn cành; cuống cụm hoa hình trụ dài 2,5-4cm, màu xanh, nhẵn. Lá bắc dạng phiến nhọn ở đầu, phía ngoài nhẵn, mặt trong có nhiều lông, dài 0,5-0,7mm, rộng 0,2-0,3mm. Cuống hoa hình trụ, nhẵn, dài 0,3-0,5cm. Hoa nhỏ đường kính 4mm, đều, lưỡng tính, mẫu 3. Bao hoa 6 phiến hình bầu dục hơi nhọn ở đầu, đều, rời, mặt ngoài nhẵn, gốc mặt trong có lông, dài 0,2-0,3cm, rộng 0,1-0,15cm, xếp xen kẽ nhau trên 2 vòng; tiền khai hoa van. Bộ nhị 4 vòng xếp xen kẽ nhau, mỗi vòng 3 nhị, vòng trong cùng nhị lép; 2 vòng nhị 1, 2 đính trên bao hoa, bao phấn 4 ô hướng trong; nhị vòng 3 bao phấn 4 ô đôi khi 2 ô, hướng ngoài, gốc có 2 tuyến hình khối nhỏ; vòng nhị lép trong cùng hình phiến, nhọn ở đầu dài 0,7-0,9mm, rộng 0,3- 0,4mm. Ô phấn hình bầu dục, xếp chồng lên nhau, nứt van. Bầu trên 1 ô, hình
bầu dục dài 0,9-1mm, nằm trên đế hoa lõm hình chén; vòi nhụy hình trụ dài 0,8-1mm, đính ở đỉnh bầu, đầu nhụy chia 3 thùy. Lá noãn 1, đính noãn treo.
1. Hình chụp toàn cây; 2. Thân cây; 3. Cành non
1. Lá mọc so le; 2. Bề mặt dưới và trên của lá; 3. Gân lá
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái lá
1. Cụm hoa; 2. Lá bắc
1. Bao hoa; 2. Nhị vòng 1; 3. Nhị vòng 2; 4a. Nhị vòng 3;
4b. Tuyến; 5. Vòng nhị lép; 6a. Bộ nhụy; 6b. Bầu cắt ngang; 6c. Noãn
Hình 3.4. Một số đặc điểm hoa
1. Hình vẽ hoa cắt dọc; 2. nhị vòng 1, 2; 3. Nhị vòng 3 cùng 2 tuyến ở gốc; 4. Nhị lép
Đặc điểm vi phẫu
- Vi phẫu thân
1. Biểu bì; 2. Mô mềm vỏ; 3. Mô cứng; 4. Libe cấp 2; 5. Gỗ cấp 2; 6. Mô mềm ruột
Hình 3.6. Vi phẫu thân
Mặt cắt của thân có hình gần tròn, từ ngoài vào trong bao gồm:
Lớp biểu bì (1) gồm lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật hay hình tròn, không đều, vách ngoài hóa cutin. Mô mềm vỏ (2) gồm 9-12 lớp tế bào xếp ngay trong biểu bì, gồm các tế bào hình đa giác hay gần tròn, kích thước không đều. Mô cứng (3) gồm các tế bào nhỏ, thành dày, xếp sít nhau, nằm phía trong
các lớp mô mềm, tạo thành một vòng bao quanh libe-gỗ. Libe cấp 2 (4) là các tế bào nhỏ, nằm ngay dưới lớp mô cứng, xếp xuyên tâm. Gỗ cấp 2 (5) gồm các mạch gỗ kích thước lớn, hình đa giác hay gần tròn phân bố rải rác trong mô mềm gỗ. Mô mềm ruột (6) là các tế bào lớn, hình đa giác hay gần tròn, thành mỏng, nằm phía trong cùng.
- Vi phẫu lá
1. Biểu bì trên; 2. Mô dày mặt trên; 3. Mô mềm; 4. Cung mô cứng trên; 5. Gỗ; 6. Libe; 7. Cung mô cứng dưới; 8. Mô mềm;
9. Mô dày mặt dưới; 10. Biểu bì dưới
Hình 3.7. Vi phẫu gân lá
Gân lá mặt trên và dưới đều lồi. Lớp biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (10) cấu tạo bởi hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật, bầu dục hay gần tròn xếp khít nhau, kích thước không đều, thành phía ngoài hóa cutin. Mô dày (2), (9) là 2- 4 lớp tế bào hình trứng, vách dày, kích thước không đều, xếp ngay phía trong biểu bì trên và dưới. Mô mềm (3), (8) gồm các tế bào kích thước lớn, thành mỏng, hình trứng nằm phía trong các lớp mô dày (2), (9). Mô cứng (4), (7)
cấu tạo từ các tế bào thành dày hóa gỗ tạo thành 2 cung trên-dưới bao quanh bó libe-gỗ, cung mô cứng dưới (7) tạo thành các bó, cung mô cứng phía trên (4) gồm các dải liên tục. Libe (6) gồm tế bào hình đa giác kích thước nhỏ xếp lộn xộn. Gỗ (5) gồm các mạch gỗ kích thước lớn xếp chồng thành hàng cách nhau 1-2 lớp tế bào mô mềm gỗ hình đa giác hay chữ nhật.
1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô khuyết; 4. Tế bào tiết tinh dầu; 5. Biểu bì dưới
Hình 3.8. Vi phẫu phiến lá
Vi phẫu phiến lá gồm có: Biểu bì dưới (4) và biểu bì trên (1) là lớp tế bào hình chữ nhật có kích thước không đều, các tế bào ở biểu bì trên lớn hơn các tế bào biểu bì dưới, thành ngoài các tế bào biểu bì hóa cutin. Mô khuyết (3) gồm 4-6 lớp tế bào hình cầu hay đa giác, để hở ra các khoảng trống. Mô giậu (2) gồm 2 lớp tế bào hình trụ, xếp sát cạnh nhau theo chiều dọc, vuông góc với lớp tế bào biểu bì trên, các tế bào mô giậu lớp phía trên có chiều dài gấp khoảng 1,5-2 chiều dài của các tế bào mô giậu lớp phía dưới. Rải rác giữa
các tế bào mô giậu và mô khuyết là các tế bào tiết tinh dầu (4) hình bầu dục hay gần tròn, có kích thước lớn.
3.1.2. Hàm lƣợng và thành phần tinh dầu
Hàm lƣợng tinh dầu
Kết quả định lượng tinh dầu trong các mẫu gỗ rễ, gỗ thân, lá cho thấy hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây Co chuông hôm là rất khác nhau:
Bảng 3.1. Hàm lượng tinh dầu các bộ phận của cây
Mẫu Khối lượng mẫu (g) Hàm ẩm (%) Thể tích Khối lượng TD Tính chất ở nhiệt độ thường HLTD (%) Gỗ rễ 50,00 10,40 0,35 ml Chất lỏng, d > 1 0,78 (ml/100g) Gỗ thân 100,50 13,26 0,20 ml Chất lỏng, d >1 0,23 (ml/100g) Lá 30,00 15,80 1,06 g Chất rắn, d < 1 4,19 (g/100g) Thành phần tinh dầu
Kết quả phân tích các mẫu tinh dầu bằng kĩ thuật GC/MS cho thấy thành phần tinh dầu gỗ rễ và gỗ thân có sự khác biệt lớn với tinh dầu trong lá của cây.
- Thành phần tinh dầu gỗ rễ
Phân tích tinh dầu gỗ rễ bằng kỹ thuật GC/MS đã xác định được 12 hợp chất, trong đó thành phần chủ yếu là Safrol (78,10%), tiếp đến là Elemicin (16,1%), Methyl eugenol (2,36%) và các hợp chất khác với tỷ lệ thấp hơn. Kết quả phân tích tinh dầu gỗ rễ được ghi lại trong bảng sau:
Bảng 3.2. Thành phần tinh dầu gỗ rễ Co chuông hôm STT Tên hợp chất Hàm lƣợng (%) 1 Safrol 78,10 2 Elemicin 16,10 3 Methyl eugenol 2,36 4 Eugenol 0,57 5 (-)-Spathulenol 0,34 6 (-)-Glubolol 0,28 7 (-)-Caryophyllen oxid 0,27 8 Camphor 0,25 9 t-Muurolol 0,21 10 Tetradecanal 0,15 11 Myristicin 0,12 12 Germacren-D 0,08 Tổng 98,83 - Thành phần tinh dầu gỗ thân
Thành phần tinh dầu gỗ thân đã xác định được cũng có thành phần chính là Safrol nhưng với tỷ lệ thấp hơn nhiều so với tỷ lệ Safrol trong tinh dầu gỗ rễ (41,87% so với gỗ rễ là 78,10%), các thành phần tiếp theo lần lượt
là 4-Methyl-2-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-3-cyclohexen-1-ol (16,13%), α-Bisabolol (4,23%), ar-Curcumen (3,52%), (-)-Spathulenol (3,26%), (-)-Globulol (2,94%). Tổng cộng có 22 hợp chất được xác định (Bảng 3.3.):
Bảng 3.3. Thành phần tinh dầu gỗ thân Co chuông hôm STT Tên hợp chất Tỷ lệ (%) 1 Safrol 41,87 2 4-Methyl-2-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-3- cyclohexen-1-ol 16,13 3 α-Bisabolol 4,23 4 ar-Curcumen 3,52 5 (-)-Spathulenol 3,26 6 (-)-Globulol 2,94 7 Isospathulenol 1,98 8 α-Cadinol 1,89 9 α-Cedren 1,88 10 Tetradecanal 1,84 11 δ-Cadinen 1,83 12 γ-Muurolen 1,06 13 Di-epi-α-Cedren I 1,03 14 β-Bisabolen 1,02 15 Leden 0,92 16 Calaren 0,88 17 γ-Curcumen 0,85 18 Camphor 0.84 19 α-Cedren 0,75 20 Epiglobulol 0,67 21 Viridiflorol 0,64 22 β-Farnesen 0,46 Tổng 90,49
- Thành phần tinh dầu lá:
Thành phần tinh dầu lá đã xác định được 9 hợp chất, trong đó thành phần chính không phải là Safrol giống như ở gỗ rễ và gỗ thân mà là Camphor với tỷ lệ rất cao 94,88%, đứng thứ 2 về tỷ lệ trong tinh dầu lá là Borneol có tỷ lệ 1,22%, thành phần này không xuất hiện ở tinh dầu gỗ rễ và gỗ thân. Thành phần tinh dầu lá được ghi lại trong bảng sau:
Bảng 3.4. Thành phần tinh dầu lá Co chuông hôm
STT Tên hợp chất Tỷ lệ (%) 1 Camphor 94,88 2 Borneol 1,22 3 (-)-Spathulenol 0,84 4 α-Terpineol 0,68 5 4-Terpinenol 0,36 6 Geraniol 0,35 7 α-Campholenal 0,35 8 DL-Limonen 0,16 9 Safrol 0,13 Tổng 98,97
3.2. Bàn luận
- Tuy chưa thể mô tả đầy đủ được các đặc điểm hình thái quả của cây do chưa thu được mẫu quả, nhưng những đặc điểm hình thái và đặc điểm vi phẫu đã mô tả bên trên cho thấy, cây Co chuông hôm mang những đặc điểm đặc trưng của chi Cinnamomum.
- Kết quả định lượng tinh dầu trong 3 mẫu gỗ rễ, gỗ thân, lá cho thấy sự khác biệt lớn về tính chất và hàm lượng tinh dầu. Tinh dầu lá ở thể rắn ở nhiệt độ thường, màu trắng hay không màu và có tỷ trọng nhỏ hơn 1 trong khi tinh dầu gỗ rễ và gỗ thân ở thể lỏng ở nhiệt độ thường, màu vàng nhạt và có tỷ trọng lớn hơn 1. Hàm lượng tinh dầu có sự biến thiên rất lớn giữa các bộ phận của cây, hàm lượng thấp nhất ở gỗ thân với chỉ 0,23% nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng tinh dầu ở lá là 4,19%.
- Phân tích thành phần tinh dầu dựa trên kỹ thuật GC/MS cho thấy sự khác biệt lớn về thành phần của các mẫu tinh dầu. Thành phần chính của tinh dầu gỗ rễ và gỗ thân là Safrol (lần lượt là 78,10% và 41,87%), tỷ lệ Camphor rất thấp (0,25% và 0,87%), trong khi đó thành phần chính của tinh dầu lá là Camphor với tỷ lệ 94,88% thành phần Safrol chỉ chiếm 0,13%.
- Thành phần chính trong tinh dầu gỗ rễ là Safrol cũng là thành phần chính trong gỗ rễ của cây Vù hương, đây có lẽ là là một trong những lí do rễ cây Co chuông hôm cũng bị khai thác mạnh để chưng cất tinh dầu.
- So sánh HLTD và tỷ lệ Camphor trong tinh dầu của lá cây Co chuông hôm với HLTD và tỷ lệ Camphor trong tinh dầu các mẫu Long não