3.1.1.Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2 đến kích thƣớc hạt:
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ calci clorid đến kích thước hạt gel alginat tạo thành.
Tiến hành:
Cân đong các natri alginat và calci clorid để pha các dung dịch natri alginat 2%, calci clorid 2%, 4%, 6%.
Tạo hạt (như ở mục 2.3.5) bằng pipet, kim 16G, kim 26G; mỗi loại tạo hạt với các dung dịch calci clorid nồng độ 2%, 4%, 6%.
Sau 30 phút, đo đường kính hạt bằng máy đo đường kính vòng vô khuẩn (theo phương pháp đã ghi ở mục 2.3.8).
Làm 10 hạt lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Bảng 3.1: Sự thay đổi đường kính hạt gel alginat theo kích thước đầu kim và nồng độ dung dịch calci clorid.
Nồng độ dung dịch CaCl2 Cỡ kim Đường kính hạt trung bình (mm) 2% 4% 6% Nhỏ (kim 26G) 2,4 2,4 2,4 Nhỡ (kim 16G) 3,9 3,9 3,9 To (pipet 5ml) 4,4 4,4 4,4 Nhận xét và bàn luận:
Kích thước dụng cụ nhỏ giọt (kích thước đầu pipet, kim 16G và kim 26G) quyết định kích thước hạt tạo thành, kích thước hạt tăng theo kích thước đầu nhỏ giọt: ở cỡ kim nhỏ (26G), đường kính trung bình hạt là d = 2,4mm, với cỡ kim nhỡ
(16G) thì hạt có đường kính trung bình d = 3,9mm và sử dụng pipet 5ml để tạo hạt (kích thước đầu pipet lớn hơn so với 2 đầu kim 16G và 26G) thì hạt trung bình có d = 4,4mm.
Do kích thước dụng cụ nhỏ giọt (cụ thể là kích thước đầu nhỏ giọt) sẽ ảnh hưởng đến lưu lượng dịch qua đầu nhỏ giọt: đầu nhỏ giọt lớn thì lưu lượng dung dịch natri alginat qua đầu nhỏ giọt sẽ lớn, sức căng bề mặt làm tạo giọt dịch hình cầu, dẫn tới kích thước giọt lớn.
Hiện nay có nghiên cứu đã tạo được các hạt gel alginat với kích thước nhỏ bé hơn như: tạo hạt kích thước 300 micromet bằng kim đường kính trong là 0,18mm và sử dụng xung điện cao áp [28];kích thước hạt 50 – 1000 micromet bằng phương pháp nhũ tương hóa/nội gel [18]; kích thước hạt 50 – 200 micromet bằng cách sử dụng mảng vi vòi phun [26].
Nồng độ calci clorid sử dụng để tạo hạt không ảnh hưởng đến kích thước hạt tạo thành: cùng sử dụng kim 26G, các nồng độ calci clorid 2%, 4% và 6% đều cho hạt với đường kính trung bình là 2,4mm; tương tự, cùng sử dụng kim 16G thì ở cả 3 nồng độ calci clorid, đường kính trung bình của hạt đều bằng 3,9mm; và với sử dụng pipet để tạo hạt, dùng calci clorid ở các nồng độ 2%, 4%, 6% đều có hạt tạo thành với đường kính trung bình là 4,4mm.
Phương pháp tạo hạt được tiến hành bằng cách nhỏ giọt dung dịch natri alginat 2% vào dung dịch calci clorid, khi giọt natri alginat rơi sẽ tạo hình cầu do sức căng bề mặt chất lỏng, đến khi giọt natri alginat rơi vào dung dịch calci clorid thì số lượng ion alginat là cố định và phụ thuộc độ nhớt dung dịch alginat, kích thước dụng cụ nhỏ giọt nên đường kính hay thể tích alginat không phụ thuộc vào nồng độ calci clorid trong dung dịch.
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ngâm trong CaCl2 lên sự hình thành hạt:
Mục đích: Xác định thời gian ngâm hạt ngắn nhất để đảm bảo toàn bộ hạt đã rắn khi thay đổi nồng độ CaCl2. Từ đó lựa chọn thời gian ngâm hạt để giảm khả năng tế bào bị chết trong khi ngâm.
Tiến hành:
Cân đong các natri alginat và calci clorid để pha các dung dịch natri alginat 2%, calci clorid 2%, 4%, 6%.
Tạo hạt (phương pháp ở mục 2.3.5) bằng pipet, kim 16G, kim 26G; mỗi loại tạo hạt với các dung dịch calci clorid nồng độ 2%, 4%, 6% theo mục 2.3.5.
Với mỗi loại hạt, đo đường kính hạt và bề dày vỏ hạt tạo thành ở các thời điểm 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 phút theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.
Làm 10 hạt lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Với hạt nhỏ (hạt được tạo bởi kim 26G), khi sử dụng calci clorid các nồng độ 2%, 4%, 6%, sau 5 phút hạt đã rắn lại. Do thời gian rắn hạt ngắn và kích thước hạt khá bé nên khó khăn trong việc cắt và đo hạt, cũng như khó xác định chính xác thời gian hạt rắn lại nên các phép đo ở thí nghiệm này thực hiện với hạt nhỡ (hạt tạo bởi kim 16G) và hạt to (hạt tạo bởi pipet).
Về tính chất hạt tạo thành sau mỗi thời gian: hạt vừa mới tạo thì mềm, dễ biến dạng, dễ vỡ; càng để lâu hạt càng chắc, khó phá vỡ hơn, sau khi hạt đã rắn thì rất bền, khi phá hạt bằng cùng một nồng độ, thể tích natri citrate và vận tốc trên máy khuấy từ thì hạt được ngâm lâu trong calci clorid sẽ mất nhiều thời gian để tan hơn.
Bảng 3.2: Sự thay đổi đường kính và bề dày lớp vỏ hạt đã tạo thành theo thời gian.
(Ghi chú: “-“ là hạt đã được tạo thành, không còn phần ruột lỏng)
Hình 3.1: Hạt bị cắt sau các khoảng thời gian ngâm khác nhau (hạt to) trong CaCl2 2% Loại hạt Nồng độ CaCl2 T(phút) Kích thước trung bình (mm) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Hạt nhỡ 2% Hạt 4,3 4,1 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 Vỏ 0,5 0,9 1,1 1,5 - - - - - 4% Hạt 4,5 4,2 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 Vỏ 0,5 0,8 1,4 - - - - 6% Hạt 4,4 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 Vỏ 0,8 1,2 - - - - Hạt to 2% Hạt 4,8 4,6 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 Vỏ 0,4 0,7 1,0 1,2 1,6 1,7 - - - 4% Hạt 4,9 4,8 4,7 4,6 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 Vỏ 0,4 1,1 1,3 1,5 2,0 - - - - 6% Hạt 4,8 4,6 4,5 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 Vỏ 0,6 1,0 1,4 - - - -
Đồ thị 3.1: Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt cố định theo thời gian của loại hạt nhỡ.
Đồ thị 3.2: Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt cố định theo thời gian của loại hạt to. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian (phút) Tỉ lệ
Thời gian (phút) Tỉ lệ
Hình 3.2: Hình ảnh hạt được tạo thay đổi theo thời gian (hạt to) ngâm trong CaCl2 2%
Nhận xét và bàn luận:
Với mỗi nồng độ calci clorid sử dụng để ngâm hạt thì kích thước hạt đều giảm theo thời gian trong quá trình hạt hình thành cho đến khi hạt đặc hoàn toàn (là khi đường kính hạt nhỡ là 3,9, đường kính hạt to là 4,4).
Cấu tạo alginat gồm đoạn mạch của polymannuronic (MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp; khi có mặt Ca2+ ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân tử alginat sắp xếp lại song
song với nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạp thành không gian trống giống hộp đựng trứng với các nếp và khe hở mà ion Ca2+ có thể chui vào, định vị và liên kết, trong khi đó các ion Ca2+ giữ các phân tử alginat lại với nhau tạo thành các chuỗi alginat [2]. Vậy theo thời gian, sự tạo gel làm các phân tử alginat sắp xếp lại song song với nhau cùng sự định vị của ion Ca2+ sẽ làm giảm tổng thể tích không gian hệ nên kích thước hạt giảm dần cho tới khi sắp xếp xong cấu trúc hạt.
Quá trình hình thành hạt xảy ra dần dần từ ngoài vào trong, phần vỏ hình thành trước, sau đó dày dần lên vào bên trong.
Do càng gần lớp vỏ ngoài, khả năng tiếp xúc của ion alginat với ion Ca2+
càng cao nên nhanh có phản ứng hơn.
Cùng một kích thước hạt, khi nồng độ calci clorid tăng dần (từ 2% đến 6%) thì thời gian rắn hạt giảm dần: với cùng là hạt nhỡ, ở nồng độ calci clorid 2% thì hạt rắn lại sau 10 phút, nồng độ calci clorid 4% thì thời gian đó là 8 phút và ở 6% calci clorid thì sau 6 phút hạt rắn lại; với kích thước hạt to, dùng nồng độ calci clorid 2% hạt thu được rắn lại sau 14 phút, 4% calci clorid thì thời gian rắn hạt là 12 phút và ở 6% calci clorid thời gian rắn hạt giảm còn 8 phút.
Do khi tăng nồng độ calci clorid, lượng ion Ca2+ tăng lên làm tăng khả năng khuếch tán vào bên trong hạt, và tăng sự tiếp xúc với ion alginat, phản ứng xảy ra nhanh hơn.
Với cùng một nồng độ calci clorid, thời gian hình thành hạt sẽ dài hơn khi kích thước hạt tăng lên: hạt nhỏ thì sau 5 phút đã rắn lại với cả 3 nồng độ calci clorid; với 2% calci clorid thì hạt nhỡ rắn lại sau 10 phút còn hạt to cần 14 phút để rắn hạt; khi sử dụng calci clorid 4%, thời gian rắn hạt nhỡ là 8 phút, còn hạt to là 12 phút; dùng calci clorid 6% sẽ có hạt nhỡ rắn lại sau 6 phút và hạt to sau 8 phút.
Do hạt càng to thì phần ruột bên trong càng cách xa lớp vỏ nên ion Ca2+ chậm khuếch tán vào bên trong ruột, phản ứng với ion alginat bên trong sẽ xảy ra muộn hơn.
Tính chất hạt thay đổi theo thời gian: khi mới tạo hạt, hạt mềm, dễ biến dạng, dễ vỡ, trong suốt; sau đó thì hạt cứng dần, chắc chắn hơn, màu sắc đục dần cho tới khi rắn hạt.
Do khi hạt chưa rắn phần trong ruột thì cấu trúc ruột lúc đó là lỏng, làm cho hạt mềm, phần vỏ ngoài còn mỏng nên hạt không bền, ruột lỏng làm cho hạt vừa tạo trong suốt; tới khi hạt đã rắn lại, nếu tiếp tục ngâm lâu hơn, các ion Ca2+ sẽ tiếp tục đi vào bên trong hạt và tạo thêm nhiều liên kết với các ion alginat còn lại, dẫn tới hạt thêm chắc và bền hơn.
3.1.3. Khảo sát lƣợng sinh khối tối đa cố định đƣợc:
Mục đích: đánh giá khả năng giữ sinh khối nấm men trong gel alginat qua quá trình tạo hạt.
Tiến hành:
Nuôi cấy nấm men theo các điều kiện đã nêu ở mục 2.3.1 và 2.3.2. Ly tâm dịch nuôi cấy (phương pháp ở mục 2.3.3). Trộn sinh khối với natri alginat 2% với các tỉ lệ khác nhau (theo phương pháp mục 2.3.4). Tạo hạt bằng kim 16G sử dụng dung dịch calci clorid 2% (theo phương pháp ở mục 2.3.5). Phá hạt (theo phương pháp mục 2.3.7). Ly tâm dịch phá hạt thu sinh khối. Cân lượng sinh khối thu được.
Kết quả:
Bảng 3.3: Lượng sinh khối giữ được sau khi tạo hạt
Lượng sinh khối trộn
Lượng alginat 2%
Lượng sinh khối sau ly tâm
Ghi chú (tỉ lệ sinh khối sau ly tâm so với lượng trước khi trộn) 5,50g 10ml 5,47g 99,45% 9,00g 8,36g 92,89% 25,00g 22,51g 90,04% (hạt bị kéo đuôi) >25,0g Không tạo giọt được 2g sinh
khối khô
10ml Không tạo giọt được
15ml Không tách rõ ràng thành hạt 20ml 6,25g Hạt bị kéo đuôi nhiều
Hình 3.4: Sắp xếp của tế bào nấm men trong cấu trúc hạt alginat dưới kính hiển vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét và bàn luận:
Khi trộn một lượng sinh khối khô (2g) với các thể tích alginat 2% khác nhau để thu các hỗn hợp với tỉ lệ sinh khối cao thì hạt khó tạo thành: 2g sinh khối khô/10ml alginat 2% không tạo giọt được; 2g sinh khối khô/15ml alginat thì không tách thành giọt mà thành các đoạn alginat; 2g sinh khối khô/20ml alginat tạo được hạt nhưng các hạt đều bị kéo đuôi. Khi dùng sinh khối ướt trộn với 10ml alginat 2% để thu hỗn hợp với tỉ lệ sinh khối cao thì 2,5g/ml kg alginat 2% sẽ tạo hạt bị kéo đuôi; tăng tỉ lệ này lên > 2,5g/ml thì không tạo được giọt. Điều này có thể giải thích như sau:
Khi tỉ lệ sinh khối nấm men đem trộn với alginat cao sẽ làm loãng đáng kể nồng độ của alginat, khi nồng độ alginat thấp hơn 2% không tạo được hạt hình cầu mà tạo ra hạt có đuôi, không đảm bảo cho cố định tế bào trong hệ gel, tới khi nồng độ alginat giảm tới 1% trở xuống thì không tạo được hạt [12].
Khi tăng tỉ lệ sinh khối so với thể tích natri alginat để tạo hạt: với lượng trộn tỉ lệ 0,55g sinh khối/1ml alginat 2% thì các hạt cố định được 99,45% lượng tế bào ban đầu; tăng tỉ lệ trộn lên 0,9 g sinh khối ướt/ml ta có lượng tế bào giữ được trong
hạt gel alginat là 92,89%; tiếp tục tăng đến 2,5g/ml thì lượng giữ được là 90,04% sinh khối đem trộn nhưng hạt tạo thành bị kéo đuôi; đến khi tăng tới 3,0g/ml thì không tạo được hạt.
Khi lượng sinh khối chưa đạt đến mức tối đa mà gel alginat có thể giữ được thì tỉ lệ sinh khối sau phá hạt và ly tâm so với lượng sinh khối đem trộn đạt trên 90%. Có thể kết luận lượng sinh khối ướt tối đa cố định trong 1ml alginat 2% là 2,5g. Do nếu tăng tỉ lệ sinh khối ướt lên trên 2,5g/ml alginat 2% thì nồng độ alginat trong dịch trộn với sinh khối quá thấp, không đủ để tạo thành hạt.
3.2.Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào trong hạt:
3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ngâm trong dung dịch CaCl2 đến khả năng giữ tế bào nấm men của hạt cố định trong nuôi cấy hiếu khí:
Mục đích: So sánh khả năng giữ tế bào nấm nen của các hạt cố định trong nuôi cấy hiếu khí khi thay đổi thời gian ngâm hạt trong calci clorid 2%.
Tiến hành:
- Ly tâm dịch nuôi cấy theo phương pháp ở mục 2.3.3.
- Cân lấy 0,4g sinh khối vừa ly tâm trộn với 40ml dung dịch natri alginat 2% như mục 2.3.4.
- Dùng kim 16G lấy 5ml hỗn hợp vừa trộn để tạo hạt với khoảng 30ml CaCl2 2% (theo phương pháp ở mục 2.3.5), ngâm trong các cốc riêng biệt 2 phút và 7 phút.
- Vớt hạt, rửa hạt bằng dung dịch NaCl 0,9% trong tủ cấy vô trùng, cho mỗi loại hạt vào một bình nón 50ml môi trường, nuôi cấy hiếu khí theo mục 2.3.6.
- Sau 24h, lọc hạt bằng vợt hạt để tách riêng hạt và dịch nuôi cấy:
Ly tâm dịch nuôi cấy, cân lại lượng sinh khối mỗi loại.
Phá hạt (ở mục 2.3.7), ly tâm dịch phá hạt, cân lại lượng sinh khối từng loại.
Kết quả:
Theo cách tiến hành, ta có lượng sinh khối ban đầu (trước khi nuôi cấy hiếu khí) trong 5ml hạt là 0,05g.
Bảng 3.4: Lượng sinh khối trong mỗi bình nuôi cấy hiếu khí sau 24h chứa các hạt với thời gian ngâm trong calci clorid là 2 phút và 7 phút.
Ngày Thời gian ngâm hạt
Lượng sinh khối (g) Tỉ lệ sinh khối (%) Dịch Hạt Tổng Dịch Hạt 20/2 2 phút 0,23 1,26 1,49 15,44 84,56 7 phút 0,28 1,27 1,55 18,06 81,94 24/2 2 phút 0,36 1,69 2,05 17,56 82,44 7 phút 0,41 1,38 1,79 22,91 77,09 10/3 2 phút 0,19 1,20 1,39 13,67 86,33 7 phút 0,24 1,18 1,42 16,90 83,10 17/4 2 phút 0,40 1,34 1,74 22,99 77,01 7 phút 0,66 1,68 2,34 28,21 71,79 Trung bình 2 phút 0,295 1,373 1,668 16,81 83,19 7 phút 0,398 1,378 1,775 21,48 79,02 Nhận xét và bàn luận:
So sánh lượng sinh khối trong mỗi bình rất nhiều so trước và sau khi nuôi cấy hiếu khí ta nhận thấy lượng tế bào sau khi nuôi cấy tăng lên với lượng tế bào ban đầu: ban đầu mỗi bình có 0,05g sinh khối trong hạt, sau 24h nuôi cấy thì có 1,6 – 1,7g sinh khối trong toàn bình.
Do trong quá trình nuôi cấy hạt cố định tế bào thì các tế bào nấm men vẫn tiếp tục phát triển.
Sau khi nuôi cấy hiếu khí, tổng lượng sinh khối trong các bình chứa các hạt cố định chứa tế bào nấm men được ngâm trong calci clorid 2 phút và 7 phút là như nhau (1,6 – 1,7g).
Trong các bình nuôi cấy hiếu khí chứa các hạt cố định tế bào nấm men với thời gian ngâm trong calci clorid 2% là 2 phút và 7 phút thì tốc độ phát triển tế bào nấm men là tương tự nhau.
Sau 24h nuôi cấy hiếu khí, các hạt cố định vẫn giữ được phần lớn tế bào nấm men: lượng sinh khối nấm men thu được sau khi phá hạt và ly tâm dịch phá hạt ở tất cả các mẻ đều chiếm trên 70% so với tổng lượng sinh khối trong bình nuôi cấy.
Do lượng tế bào nấm men chứa trong mỗi loại hạt sau khi nuôi cấy vẫn chưa đạt lượng tối đa mà gel alginat có thể giữ được (2,5g sinh khối /ml alginat theo kết quả khảo sát ở mục 3.1.3) nên phần lớn tế bào sinh ra thêm trong quá trình nuôi cấy không bị thoát ra ngoài hạt cố định.