2.1.2.1. Nguyên liệu
- Chất chuẩn Metoprolol Tartrat (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương): 100,37%: [C15H25NO3]2C4H6O6
Độ ẩm: 0,01% SKS: WS.0107228
BQ: 5°C – Tránh ánh sáng.
- Dung môi: Methanol (Merck-Đức), nước cất 2 lần được loại bỏ ion, acetonitril tinh khiết (Merk-Đức).
- Natri pentansulfonat monohydrat, Natri acetat. - Dung dịch: HCl đặc, acid acetic đặc.
2.1.2.2. Thiết bị
- Máy huỳnh quang: Agilent Technologies Cary Eclipse Fluorescence (Aligent Technologies – Mỹ).
- Máy HPLC: Aligent Technologies 1200 series (Aligent Technologies - Mỹ).
- Máy cất nước 2 lần Hamilton (Hamilton – Anh). - Bộ màng lọc mẫu 0,20µm.
- Bơm tiêm, lọ đựng mẫu HPLC.
- Bơm hút chân không Supelco (Supelco – Mỹ).
- Bộ dụng cụ lọc chân không Supelco (Supelco – Mỹ). - Máy lọc nước: Maxima Ultra pure water (Elga – Anh). - Máy siêu âm: Utrasonic LC 60H (ELMA –Đức). - Cân phân tích Sartorius (Sartorius- Đức).
- Các dụng cụ khác:
Bình định mức loại 10ml, 50ml, 100ml. Micropipet 100-1000l.
Pipet chính xác loại 25ml. Cốc có mỏ loại 100ml, 200ml. Quả bóp cao su.
Đũa thủy tinh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng quang phổ huỳnh quang
Khảo sát chọn cặp bước sóng kích thích và phát xạ
- Tham khảo các tài liệu để dự đoán cặp bước sóng kích thích và phát xạ. - Chọn bước sóng kích thích cố định, quét phổ phát xạ, chọn bước sóng phát
xạ mà tại đó đáp ứng là cực đại.
- Tương tự, ta chọn bước sóng kích thích.
2.2.2.1. Thẩm định tính chọn lọc của phương pháp
- Quét phổ dung dịch chất chuẩn hòa tan trong dung môi. - Quét phổ dung dịch thử hòa tan trong dung môi.
- So sánh các phổ trên.
- Yêu cầu: Phổ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương tự nhau và có cùng điểm cực đại.
2.2.2.2. Khảo sát khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang đo được
- Thường làm từ 5 – 7 nồng độ của chất phân tích. Mối tương quan giữa cường độ đo được và nồng độ chất phân tích được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy.
- Yêu cầu: Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và hệ số tương quan hồi quy R ≥ 0,995.
2.2.2.3. Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp
- Tiến hành phân tích 6 phép thử song song trên một mẫu chế phẩm. - Tính kết quả dựa vào đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện.
- Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng.
- Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2%.
2.2.2.4. Kiểm tra độ đúng của phương pháp
- Xác định bằng phương pháp thêm chuẩn:
Mẫu thử: Chế phẩm được pha thành dung dịch.
Mẫu thử + chuẩn: Dung dịch chế phẩm + một lượng xác định chất chuẩn. Các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính.
- Khảo sát với 3 mức thêm vào của chất chuẩn: 10%, 20%, 30%. Ở mỗi mức thêm vào tiến hành 3 phép thử riêng biệt.
RSD ≤ 2%.
2.2.2.5. Sử dụng phương pháp HPLC làm phương pháp đối chiếu
- Chuẩn bị mẫu nghiên cứu và điều kiện sắc ký theo chuyên luận viên nén metoprolol tartrat trong Dược điển Mỹ(2009).
- Đánh giá tính phù hợp của hệ thống.
- So sánh kết quả định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm giữa 2 phương pháp quang phổ huỳnh quang và HPLC.
2.2.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm
Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, áp dụng để định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm viên nén đang lưu hành ở Việt Nam.
2.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm [4]
So sánh kết quả của phương pháp quang phổ huỳnh quang và HPLC bằng kiểm định thống kê toán học được tiến hành với mức tin cậy 95%.
Giá trị trung bình: X̅ = ∑ Xi n i=1 n (2.3) Phương sai: S2 = ∑ (Xi− X̅)2 n i=1 (n − 1) (2.4) Độ lệch chuẩn: SD = √S2 (2.5)
Độ lệch chuẩn tương đối:
RSD = SD
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng quang phổ huỳnh quang
3.1.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử
Chuẩn bị mẫu chuẩn
- Pha dãy dung dịch metoprolol tartrat chuẩn: 1200, 1600, 2000, 2400, 2800, 3200ng/ml.
+ Pha dung dịch metoprolol tartrat gốc 105mg/ml: Cân chính xác khoảng 0,01g chất chuẩn cho vào bình định mức 100ml, thêm khoảng 80ml methanol và lắc đều, siêu âm khoảng 20 phút, bổ sung methanol vừa đủ. + Pha dãy dung dịch chất chuẩn trong bình định mức 10ml từ dung dịch gốc 105ng/ml.
Chuẩn bị mẫu thử:
- Cân chính xác khối lượng 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.
- Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 50mg metoprolol tartrat, cho vào bình định mức 100ml, thêm khoảng 80ml methanol, lắc, siêu âm khoảng 20 phút và thêm methanol cho vừa đủ. Lọc, loại bỏ 20 – 30ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 0,04ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều, được dung dịch thử có nồng độ 2000ng/ml.
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng định lượng
Trên cơ sở tham khảo tài liệu [9], [11], [14], để chọn bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ chúng tôi tiến hành quét phổ như sau:
- Chọn bước sóng phát xạ :
Chúng tôi cố định bước sóng kích thích ở 225nm, quét phổ phát xạ để tìm bước sóng bức xạ cực đại, xác định được cực đại phát xạ tại 299nm.
Hình 3.1. Phổ phát xạ của metoprolol tartrat nồng độ 2000ng/ml. - Chọn bước sóng kích thích:
Tương tự, chúng tôi cố định bước sóng phát xạ là 299nm, quét phổ kích thích, xác định được cực đại kích thích tại 224nm.
Hình 3.2. Phổ kích thích của metoprolol tartrat 2000ng/ml.
Kết luận: Từ kết quả thu được, chúng tôi sơ bộ xác định được điều kiện phân tích:
- Dung môi hòa tan: Methanol.
- Bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ: 224nm, 299nm.
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng metoprolol tartrat
3.1.2.1. Thẩm định tính chọn lọc của phương pháp.
Hình 3.3. Phổ kích thích của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng độ khoảng 2000ng/ml.
Hình 3.4. Phổ phát xạ của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng độ khoảng 2000ng/ml.
Nhận thấy phổ kích thích và phát xạ của chất chuẩn và chất thử tương tự nhau và có cùng điểm cực đại. Do đó ta có thể khẳng định tá dược trong chế phẩm không làm ảnh hưởng đến phép đo huỳnh quang, ta có thể tiến hành phép định lượng.
3.1.2.2. Độ tuyến tính
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn metoprolol tartrat có nồng độ 1200, 1600, 2000, 2400, 2800, 3200ng/ml. Tiến hành đo cường độ huỳnh quang. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của metoprolol tartrat.
STT Nồng độ (ng/ml) Cường độ đo được
1 1200 260,981 2 1600 332,844 3 2000 408,990 4 2400 481,883 5 2800 557,098 6 3200 629,095
Phương trình hồi quy y= 0,1847x + 38,472
Hình 3.5. Đường hồi quy tuyến tính của metoprolol tartrat.
Nhận xét: Với điều kiện đã được chọn, trong khoảng khảo sát, giữa cường độ huỳnh quang đo được và nồng độ metoprolol tartrat có mối tương quan tuyến tính rất tốt.
3.1.2.3. Độ lặp lại
Xác định độ lặp lại dựa trên kết quả thống kê 6 lần định lượng dung dịch thử metoprolol tartrat như mục 3.1.1. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2:
y = 0.1847x + 38.742 R² = 0.9999 0 100 200 300 400 500 600 700 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 C ường độ hu ỳnh qua ng ( a.u) Nồng độ metoprolol tartrat (ng/ml)
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp.
STT Lượng cân mẫu thử (g)
Cường độ đo được (AU)
Hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn (%) 1 0,1544 387,228 96,67 2 0,1582 401,620 98,23 3 0,1506 378,300 96,56 4 0,1518 380,875 96,55 5 0,1536 388,883 97,63 6 0,1532 383,964 96,50 TB = 97,02% RSD = 0,75%
Nhận xét: Kết quả cho thấy phép phân tích có RSD < 2% nên phương pháp có độ lặp lại tốt, đáp ứng yêu cầu thẩm định chế phẩm.
3.1.2.4. Độ đúng
Tiến hành: Hút chính xác 0,04 ml dịch lọc của chất thử (pha như trong mục 3.1.1) vào các bình định mức 10ml riêng biệt. Lần lượt thêm 0,02ml; 0,04ml; 0,06ml; dung dịch chuẩn metoprolol tartrat 105ng/ml (pha như trong mục 3.1.1) vào các bình ở trên. Thêm methanol tới vạch, lắc đều, được các dung dịch thử đã thêm 10%, 20%, 30% lượng hoạt chất metoprolol tartrat.
Tiến hành phép đo quang, dựa vào đường chuẩn xác định được lượng chất chuẩn thêm vào tìm thấy được bằng thực nghiệm so với lý thuyết (%). Kết quả khảo sát độ đúng được thể hiện trong bảng 3.3:
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ đúng.
STT Lượng thêm vào (%) Lượng cân mẫu thử (g) Cường độ đo được (AU) Tỷ lệ tìm thấy (%) 1 10 0,1536 424,257 101,64 2 10 0,1518 419,119 98,77 3 10 0,1544 426,210 102,02 4 20 0,1536 460,409 99,75 5 20 0,1518 457,029 100,70 6 20 0,1544 463,294 101,20 7 30 0,1536 499,443 101,72 8 30 0,1518 492,717 99,33 9 30 0,1544 498,564 99,30 TB = 100,49% RSD = 1,22%
Nhận xét: Kết quả cho thấy tỷ lệ tìm lại đều ở mức cao (98,77- 102,02%) và RSD < 2% nên phương pháp cho độ đúng cao, đảm bảo cho các phép phân tích xác định hàm lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm.
3.1.2.5. Sử dụng phương pháp HPLC làm phương pháp đối chiếu
Chuẩn bị mẫu nghiên cứu và điều kiện sắc ký [19]
Theo chuyên luận viên nén metoprolol tartrat trong Dược điển Mỹ (2009):
- Hỗn hợp dung môi: Phối hợp methanol và acid HCl 0,1N (1: 1, tt/tt). - Pha động: hòa tan 961mg natri pentansulfonat và 82mg natri acetat trong
hỗn hợp của 550ml methanol và 470ml nước, sau đó thêm 0,57ml acid acetic băng.
- Dung dịch chuẩn: Pha chất chuẩn metoprolol tartrat trong hỗn hợp dung môi để tạo thành dung dịch có nồng độ khoảng 1000µg/ml. Hút chính xác 25ml dung dịch trên vào bình định mức 50ml, thêm pha động đến vạch, lắc, lọc. - Dung dịch thử: Cân chính xác khối lượng của 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 50mg metoprolol tartrat cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml hỗn hợp dung môi, lắc bằng máy 30 phút, siêu âm 15 phút và làm ấm khoảng 10 phút. Khi nhiệt độ dung dịch bằng nhiệt độ phòng, thêm hỗn hợp dung môi đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 25ml dung dịch trên vào bình định mức 50ml, thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc 0,5µm, bỏ vài ml dịch lọc đầu.
- Điều kiện sắc kí : Cột: C18 5µm; 4,6mm × 25cm Detector: 254nm Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20µl Kết quả
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn metoprolol tartrat 500µg/ml.
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch thử metoprolol tartrat khoảng 500µg/ml.
Chuẩn bị mẫu chuẩn 500µg/ml, tiến hành phân tích như điều kiện ở trên, tiêm mẫu 6 lần liên tiếp. Kết quả các thông số được trình bày ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC.
Lần tiêm Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
1 6,744 631,8 2 6,657 631,6 3 6,712 631,7 4 6,620 632,3 5 6,683 631,8 6 6,645 632,2 TB 6,677 631,9 RSD 0,68 0,04
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của các thông số đều nhỏ hơn 2%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận được, có thể thực hiện phân tích cho kết quả tin cậy được.
Chuẩn bị mẫu thử như mục trên, tiến hành phân tích 6 lần. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng metoprolol tartrat bằng phương pháp HPLC.
STT Lượng cân mẫu (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng thực tế so với nhãn (%) 1 0,1589 630,1 98,0 2 0,1647 649,5 97,45 3 0,1574 625,3 98,17 4 0,1576 620,2 97,25 5 0,1597 630,9 97,63 6 0,1625 640,4 97,39 TB = 97,65% RSD = 0,37 %
Căn cứ vào bảng 3.2 và bảng 3.5, ta có kết quả thống kê:
F = S1
2
S22 = 4,03 < Fc( 0,05; 5; 5 ) = 5,05
ttn = 1,893 < tc( 0,05; 10 ) = 2,228
Kết quả cho thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về kết quả định lượng của 2 phương pháp quang phổ huỳnh quang và HPLC.
3.1.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng trong chế phẩm
Trên cơ sở điều kiện phương pháp quang phổ huỳnh quang đã xây dựng, tiến hành định lượng viên Betaloc hàm lượng metoprolol tartrat 50mg.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,05g chất chuẩn cho vào bình định mức 100ml, thêm khoảng 80ml methanol, siêu âm 20 phút, pha loãng bằng methanol đến vạch, được dung dịch có nồng độ
10ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều, được dung dịch chuẩn có nồng độ 2000ng/ml.
- Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.1.1.1.
- Tiến hành đo quang ở bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ 224nm, 299nm. Tiến hành phân tích 3 lần đối với chế phẩm thử.
- Hàm lượng metoprolol tartrat so với lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức:
% Hàm lượng = k × h × (1 − a) × mc×It×m̅
mt×Ic×b × 100
Trong đó:
It, Ic: Cường độ huỳnh quang đo được của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
k: Hệ số pha loãng.
mt, mc: Khối lượng bột tương ứng của chế phẩm thử và chuẩn. m̅: Khối lượng trung bình viên.
h: Hàm lượng metoprolol tartrat chuẩn.
a: Phần trăm hàm ẩm của metoprolol tartrat chuẩn. b: Hàm lượng ghi trên nhãn của viên.
Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Kết quả định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm viên nén.
STT Lượng cân mẫu (g)
Cường độ đo được (AU) Hàm lượng (%) Chuẩn 0,0545 425,618 1 0,1624 395,170 97,96 2 0,1597 387,309 97,63 3 0,1638 392,642 96,50
TB 97,36
Nhận xét: Theo Dược điển Mỹ (2009), chế phẩm viên nén có hàm lượng metoprolol tartrat là 90,0 – 110,0% so với lượng ghi trên nhãn. Do đó chế phẩm Betaloc đạt quy định về hàm lượng.
3.2. Bàn luận
Quang phổ huỳnh quang là phương pháp hiện đại bởi những ưu điểm nổi trội về độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Phương pháp mà chúng tôi đưa ra sử dụng là phương pháp quang phổ huỳnh quang góp phần bước đầu tiêu chuẩn hóa cho chế phẩm viên nén metoprolol tartrat mà Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận riêng nào.
Phương pháp dễ thực hiện, cho kết quả nhanh chóng, độ đúng và độ lặp lại cao, điều kiện máy móc đơn giản. Phương pháp sử dụng dung môi phổ biến là methanol, không phải tuân thủ trong điều kiện nhiệt độ và pH nghiêm ngặt. Tuy nhiên khi sử dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang cần chú ý những tác nhân làm tắt huỳnh quang, mà trong điều kiện khóa luận vẫn chưa tiến hành khảo sát.
Trong khóa luận, phương pháp HPLC trong Dược điển Mỹ (2009) được sử dụng là phương pháp đối chiếu với phương pháp quang phổ huỳnh quang. Kết quả thống kê với độ tin cậy 95% cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p = 0,05) về giá trị hàm lượng thực tế so với nhãn giữa 2 phương pháp. Mặt khác, phương pháp HPLC với thao tác phức tạp hơn, cần nhiều hóa chất cho pha động, trong đó có những hóa chất không phổ biến như natri pentansulfonat. Do đó phương pháp quang phổ huỳnh quang được xây dựng có thể hoàn toàn thay thế phương pháp HPLC để định lượng metoprolol tartrat trong các chế phẩm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dựa vào kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
Đã xây dựng được chương trình định lượng metoprolol tartrat bằng phương