Hợp chất (±) este methyl-2-clorophenylglycin có công thức như sau:
Phổ hồng ngoại (2) được trình bày trong phụ lục 5
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của (2) được trình bày trong bảng 3 Bảng 3: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của (±) ester
methyl-2- clorophenylglycin ^ímax(crn'') Nhóm 3383 -N H2 2951 - CH3 no 1738 >c=0 ester 1593;1478;1440 -C=C- vòng thơm
3.2.2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của họp chất (2) được trình bày trong phụ lục 9 . Kết quả biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân trình bày trong bảng 4
Bảng 4; Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của (±) ester methyl-2- clorophenylglycỉn C ôn g thức (± ) ester m e th y l-2 -c lo r o p h e n y lg ly c in N h ó m 2Ỉ H2N 3' 2 5 (ppm ) V ị trí 3 ,7 0 2 3H , s, 0C H3 5 ,0 0 IH , s, H -2 7 ,2 4 2H , m , H -4 ’ và H -5 ’ 7 ,3 4 IH , d, H -6’ (J= 7.5 H z) 7 ,3 7 IH , d, H -3 ’ (J = 7 .5 H z) 3.2.3, Nhận xét
- Kết quả phân tích phổ cho thấy hợp chất mà chúng tôi tổng họp được có công thức phù hợp với công thức của (±) ester methyl-2-clorophenylglycin. - Phản ứng ester hóa nhóm -COOH của (±)-2-clorophenylglycin bằng MeOH, trong đó MeOH được lấy dư với mục đích vừa là dung môi, vừa là tác nhân phản ứng. Phản ứng diễn ra trong thời gian dài (32h-40h) cho H=67.55%. Sản phẩm thu được ở dạng dầu màu vàng, trên SKLM cho 1 gọn, rõ.
- Phản ứng yêu cầu thực hiện trong môi trường khan hoàn toàn, vì nếu lẫn nước, hiệu suất phản ứng sẽ giảm rõ rệt. Vì vậy, MeOH cần loại nước trước khi tham gia phản ứng, sản phẩm (1) cũng cần làm khô hoàn toàn
3.3. Tổng hợp 2- thienylethyl-/7-toIuenesuIphonat
3.3.1. Thực nghiệm
Hợp chất 2 thienylethyl-p-toluensulphonat được tổng họp từp-toluen sulfonyl clorid và 2-(2-thienyl)ethanol Sơ đồ phản ứng: p L ? " * 0 Et,N DCM o 0 3 CH3 Tiến hành
Trong bình cầu 2 cổ chứa hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 ml DCM, 1,473 g p- toluensulfonyl chlorid được làm lạnh ở nhiệt độ 7.5”c trong 20 phút, thêm vào 0,75 g thiophen-2-ethanol, 1,35 ml triethylamin. Tăng dần nhiệt độ phản ứng lên 30°c và giữ trong 5 h. Phản ứng được theo dõi bằng SKLM, hệ dung môi n-hexan:ethylacetat = 9:1. Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn họp phản ứng 5 ml nước, chiết bằng 3 lần bằng DCM, gộp phần dịch chiết DCM, rửa lại với nước, làm khan bằng Na2S0 4 và bốc hơi dung môi thu được 1.45 (g) sản phẩm thô, hiệu suất đạt 88%.
SKLM của sản phẩm 3 được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 70 - 230 mesh, hệ dung môi n-hexan : ethylacetat = 9 : 1 , hiện màu bằng thuốc thử iod cho 1 vết gọn, rõ (phụ lục 1)
3.3.2. Cấu trúc hợp chất 2-thienylethyl-p-toỉuensulphonat
Sản phẩm của phản ứng được chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hưỏTig từ hạt nhân tại Viện hóa học Việt Nam để xác định cấu trúc. Kết quả ghi phổ được trình bày tại phụ lục 6, 10.
3.3.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại
Hợp chất 2- thienylethyl-p-toluensulphonat có công thức như sau
o
o— s- CH,
Õ
Phổ hồng ngoại của (3) được trình bày trong phụ lục 6
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của (3) được trình bày trong bảng 5
Bảng 5: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của 2- thỉenylethyl p-toluensulphonat ^max (c m ) N h ó m 3 1 0 7 H -(= C H2) 2 9 5 8 H (-C H s) 1373 SO2 1 6 0 1 ;1 4 5 9 - C = C - v ò n g thơm 1181 c=s
8 26 T hê para-di v ò n g b en zen
3.3.2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất (3) được trình bày trong phụ lục 10. Kết quả biện giải phổ cộng hưỏng từ hạt nhân trình bày trong bảng 6.
Bảng 6: Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của 2- thỉenylethyl-p- toluensulphonat 2- thienylethyl-p-toluensulphonat Nhóm ỗ (ppm) 2,439 3,17 o- o ■ s- 0 4,22 2' 3' T \ _ y 6' 5’ CH, 6,79 6,90 7,13 7,31 7,73 VỊ trí 3H, s, CH3 2H, t,H -a(J=6.7H z) 2H, t, H-b (J=6.5 Hz) IH, d, H-3 IH, m,H-4 2H, d, H-5’ và H-3’ 2H, d ,H -6’ và H-2’ 3.3.2.3. Phân tích phổ NMR
Kết quả phân tích phổ '^c NMR của họp chất tổng hợp được cho thấy tín hiệu trên phổ đồ tưong ứng phù họp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon
3.3.3. Nhận xét
- Kết quả phân tích phổ hồng ngoại trong bảng 5 cho thấy có phản ứng thế giữa /7-toluensulfonyl clorid và 2-(2-thienyl)ethanol tạo 2- thienylethyl- p
-toluensulphonat. Kết quả phân tích phổ cộng hưcmg từ hạt nhân của hợp chất mà chúng tôi tổng họp được phù hợp với công thức của (3).
- Phản ứng xảy ra theo cơ chế sự cộng họp tách loại HCl, dễ dàng xảy ra trong các dung môi kém phân cực với xúc tác base hữu cơ (EtsN...). Để tránh độc hại và trong điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn dung môi là DCM.
- Phản ứng thu được hiệu suất cao (88%), nhưng sản phẩm phản ứng không tinh khiết (qua kiểm tra bằng SKLM). Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế lại sản phẩm bằng phương pháp chạy cột với chất hấp phụ là silicagel, hệ dung môi rửa giải là n-hexan : ethyl acetat với độ phân cực tăng dần từ 100:0
đến 95:5.
3.4. Tổng hợp (±)-methyl-a-(2-(thiophen-2-yl)ethylamino)-2-(2- clorophenyl)acetat hydroclorid
3.4.1. Thực nghiệm
Sản phẩm (4) được tổng hợp từ (±) ester methyl-2-clorophenylglycin và 2- thienylethyl-p-toluensulphonat
Sơ đó phản ứng: CO2CH3 cr o 0— s- 0 KH2PO4, CH3 toluen:92Ì;c ^ HCI .HCI Tiến hành
Cho vào bình cầu 10 ml 0,5 (g) (±) ester methyl-2-clorophenylglycin, l(g) 2-thienylethyl-p-toluensulphonat, 0,75 g KHPO4, 5,7 ml toluen. Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ 92,5°c trong 30 h. Để nguội hỗn họp phản ứng về nhiệt độ phòng. Chiết 3 lần bằng 30 ml DCM, gộp phần dịch chiết DCM lại, rửa bằng nước, bốc hơi dung môi thu được cắn dạng dầu. Thêm vào cắn 3 ml toluen, làm lạnh về nhiệt độ ll° c , thêm 0,15 ml HCl 12 N, khuấy trong 30 phút. Tăng nhiệt độ phản ứng lên 58,5°c trong 20 phút thấy xuất hiện kết tinh. Lọc lấy kết tinh, rửa bằng toluen, sau đó cho vào bình cầu 5 ml. Kết tinh lại trong 1,75 ml aceton, 0,15ml HCl và để ở nhiệt độ 58,5°c trong 20 phút, rồi giảm nhiệt độ xuống 1 l°c trong 30 phút. Lọc rửa kết tinh bằng aceton, thu được 0,464 (g) sản phẩm thô, hiệu suất đạt 58,57 %, nhiệt độ nóng chảy
t=219,5°c
Chạy SKLM của sản phẩm (4), sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 70 - 230 mesh, hệ dung môi n-hexan:ethylacetat = 9:1, hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff cho 1 vết rõ, gọn (phụ lục 1)
3.4.2. cấu trúc hợp chất (±)-methyl-a-(2-(thiophen-2-yl) ethylamỉno)-2- ( 2-dorophenyl)acetat hydroclorid
Đe xác định cấu trúc của 4, chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân tại Viện hóa học Việt Nam. Kết quả được trình bày trong phụ lục (7), (11) 3.4.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại Hợp chất (4) có công thức là: V HN' cr .HCI
Phổ hồng ngoại của (4) được trình bày trong phụ lục 7
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại được trình bày trong bảng 7
Bảng 7: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của (±)-methyl-2- (2-(thỉophen -2- yl)ethylamỉno)-2-(2-cỉorophenyl)acetat hydroclorỉd
\)max(cm‘’) Nhóm
3434 H (-NH-)
2897 H (- CH3)
1749 > c=0 ester
1594; 1492 -C=C- vòng thơm
3.4.2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất (4) được trình bày trong phụ lục 11, Kết quả biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân được trình bày trong bảng 8.
Bảng 8: Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của của (±) - methyl- a - ( 2 - ( thỉophen — 2 —yl) ethylamỉno) — 2 — (2 — clorophenyl)acetat hydroclorid
o . ^0 1 Nhóm ỗ (ppm) Vị trí 3.04 IH, m, H-2” 3.15 IH, m, H-2” 3.30 2H, m, ‘H-1” 3.74 3H, s, CHs 5.61 IH, s, C^H-2 6.91 IH, d,H -5’ 6.96 IH, d, H-4’ 7.37 IH, d,H -3’ 7.51 2H, m, H-d +H-e 7.62 IH, d, H-f 7.76 IH, d, H-c
3.4,3. Nhận xét:
- Kết quả phân tích phổ cho thấy họp chất mà chúng tôi tổng họp được phù họp với công thức (4)
- Đây là phản ứng thế nucleophin, hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Xúc tác, dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng...trải qua nhiều giai đoạn phức tạp, hiệu suất không cao.
3.5. Tổng hợp Clopidogrel racemic
3.5.1. Thực nghiệm
Clopidogrel racemic được tổng hợp từ (±)-methyl 2-(2-(thiophen-2-yl) ethylamino)-2-(2-clorophenyl)acetat hydroclorid và dung dịch formaldehyd.
Sơ đồ phản ứng CO2CH3 (CH20)n-H20 t° phßng 24 h CO2CH3 Tiến hành
Trong bình cầu 25 ml chứa 0,167 g sản phẩm (4), thêm 3ml dung dịch HCHO 30% trong nước, đặt nhiệt độ 30°c. Theo dõi phản ứng bằng SKLM, với hệ dung môi n-hexan : ethylacetat ==9:1. Sau 24h thấy phản ứng kết thúc. Chỉnh hỗn hợp phản ứng về pH = 7-8 với K2CO3 10 %. Sau đó chiết 3 lần, mỗi lần với 5 ml DCM, gộp phần dịch chiết DCM lại, rửa với nước, bốc hơi dung môi thu được 0,1343 (g) sản phẩm thô, hiệu suất đạt 86,30 %.
Chạy SKLM của sản phẩm (5), sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 70 - 230 mesh, hệ dung môi n-hexan:ethylacetat = 9:1, hiện màu với thuốc thử dragendorff cho một vết gọn, rõ (phụ lục 1)
3.5.2. Cấu trúc hợp chất Clopidogrel racemic
Đe xác định cấu trúc sản phẩm 5, chúng tôi tiến hành đo phổ khối, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân tại Viện hóa học Việt Nam. Đồng thời, chúng tôi kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp HPLC. Kết quả được trình bày trong phụ lục 3, 8, 12, 13,14
3.5.2.1. Phân tích phổ khối
Phổ khối của (5) được trình bày trong phụ lục 3
Từ kết quả phổ khối ta thấy xuất hiện pic 322.1 trùng với khối lượng phân tử của Clopidogrel racemic.
3.5.2.2. Phân tích phổ hồng ngoại
Hợp chất Clopidogrel racemic có công thức là:
Phổ hồng ngoại (5) được trình bày trong phụ lục 8
Kết quả phân tích phổ được trình bày trong bảng 9
Bảng 9: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của (±)-clopỉdogrel
t>max(cm'') N h ó m
3 0 6 4 H - c k h ôn g no
2 9 6 5 H - C H O
17 40 > c=0 ester
1570 -C = C - v ò n g thơm
3.5.2.3. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của (5) được trình bày trong phụ lục 12 Kết quả phân tích phổ được trình bày trong bảng 10
3.5.2.4. Phân tích phổ NMR
Phổ NMR của sản phẩm (5) được trình bày trong phụ lục (14).
Kết quả phân tích phổ NMR của hợp chất tổng hợp được cho thấy tín hiệu trên phổ đồ tương ứng phù hợp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon
3.5.2.5. Phân tích phổ HPLC
Phổ HPLC của sản phẩm (5) được trình bày trong phụ lục (13)
Qua sắc ký đồ HPLC của sản phẩm (5) chúng tôi thấy: Thời gian lưu của (5) là 18 phút. Tại thời điểm 10 phút thấy xuất hiện pic của tạp. Xác định độ tinh khiết của (5) qua tính tỉ lệ diện tích pic cho kết quả 97,12 %
3.5.3. Nhận xét
- Kết quả phân tích phổ cho thấy có phản ứng đóng vòng giữa (4) và formaldehyd tạo sản phẩm có công thức cấu tạo phù hợp với (5).
- Chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ chất phản ứng (±)-methyl- a-(2-(thiophen-2-yl)ethylamino)-2-(2-clorophenyl)acetat hydroclorid với tác nhân phản ứng lên hiệu suất phản ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 11. Bảng 11 : Ảnh hưởng tỷ lệ (±)-methyl-a-(2-(thiophen-yl)ethylamino)-2-(2- clorophenyl)acetat hydroclorid (4) với tác nhân phản ứng lên hiệu suất phản ứng: T ỷ lệ m o l (4):tác nhân phản ứ n g T ác nhân phản ứ n g N h iệt độ phản ứ n g ? C ) T hời gian phản ứng (h) H iệu suất phản ứng(% ) 1:10 ,32 D u n g d ịch form al d eh yd 30% 30 2 4 64 ,5 1:16,4 D u n g d ịch fo n n a ld eh y d 30% 3 0 2 4 7 0 ,8 1:22 ,96 D u n g d ịch form ald eh yd 30% 30 2 4 86,1
Từ bảng trên ta thấy, khi tỉ lệ (4):formaldehyd = 1:22,96 thì hiệu suất phản ứng đạt cao nhất.
Phản ứng xảy ra dễ dàng theo cơ chế cộng hợp đóng vòng, hiệu suất cao (86%), quá trình thực hiện đon giản. Lượng dung dịch formadehyd 30 % cần lấy dư nhiều so với lượng cần phản ứng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat nhận thấy sau 8h, trên sắc ký đồ vẫn còn vết của (4); sau 24h, không thấy còn vết của (4). Đe thu được sản phẩm tinh khiết, sản phẩm thu được sau phản ứng được mang đi chạy cột với pha tĩnh là silicagel (lượng silicael gấp 40 lần khối lượng chất), hệ dung môi rửa giải là n-hexan:EtOAc với độ phân cực tăng dần từ 100:0 đến 95:5. Sản phẩm thu được từ chạy cột được đo phổ HPLC cho thấy độ tinh khiết là 97,12 % (tính theo diện tích pic)
CHƯƠNG 4
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
Kết luận
Sau thời gian thực hiện khóa luận, chúng tôi đã đạt được những mục tiêu đề ra là;
- Nghiên cứu xây dựng được phương pháp tổng hợp (±)-methyl-2-(2- clorophenyl)-2-(6,7-dihydrothieno[3,2-c]pyridin-5(4H)-yl)acetat.
- Cấu trúc hóa học của các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối đã được kiểm chứng bằng các phương pháp hóa lý như IR, MS, ’H - NMR... cho kết quả phù hợp với các công bố trên thế giới. Bằng phương pháp HPLC đã xác định được hàm lượng clopidogrel racemic trong sản phẩm thu được đạt 97,12%
Các kết quả bước đầu này hứa hẹn việc tổng hợp clopidogrel dược dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc generic tại Việt Nam hoàn toàn khả thi.
Đe xuất
- Tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố như dung môi, nhiệt độ... đến hiệu suất từng phản ứng trong quá trình tổng họp để thu được sản phẩm với hiệu suất cao nhất.
- Nghiên cứu tách ester (+)-methyl-2-clorophenylglycin từ hỗn hợp (±) ester methyl-2-clorophenylglycin dùng tổng họp (S)-(+)-methyl-2-(2- clorophenyl)-2-(6,7-dihydrothieno[3,2-c]pyridin-5(4H)-yl)acetat để có thể tạo ra được clopidogrel dược dụng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích IINXB Y học, trang 62 - 67, trang 107- 123, 9 9 - 106
2. Bộ môn hóa hữu cơ (2007), Hóa hữu cơ I, NXB Y học, trang 92-94 3. Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm I, NXB Y học,
trang 63-70, 121-122
4. Nguyễn Văn Tài, Nguyễn Thị Thu Trang, Lê Thị Xoan, Nguyễn Thị Hà (2010), Bước đầu tổng hợp (±)-clopidogrel, tạp trí Dược liệu, số 15(3), trang 149-153
5. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý IINXB Y học, trang 124, 113 -114
Tiếng anh
6. Aubert et al (1985), Thieno[3,2-c] pyridine derivatives and their therapeutic application,USP4529596
7. Badorc et al (1989), Dextro-rotatory enantiomer o f methyl alpha —
5(4,5,6,7-teừ"ahydro(3,2-c) thieno pyridyl)(2-chlorophenyl)-acetate and
the pharmaceutical comopositions containing it, USP4847265
8. Barkonyi et al (2001), Process o f a pharmacologically active
substance, ƯSP6180793
9. Jean-marie Pereillo et al {20^2),Structure and stereochemistry o f the active metabolite clopidogrel,Đmg metabolism and dispodition, vol.
30,no. 11
10. Kumar et al (2010), Process fo r preparation o f crystalline clopidogrel
11. Sajja et ai (2007), Process fo r preparing clopidogrel, USP0225320 12. Terry K.W.Ma et al (2010), Impact o f generic and acquired alteration
in cytochrome P450 system on pharmacologic and clinical response to
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: SKLM của các chất 1, 2, 3, 4, 5
Phụ lục 2: Phổ khối của (±)-methyl-2-clorophenylglycin
Phụ lục 3: Phổ khối của clopidogrel racemic
Phụ lục 4: Phổ hồng ngoại của acid a-amino- (2-clorophenyl)acetic
Phụ lục 5: Phổ hồng ngoại của (±)ester methyl-2-clorophenylglycin
Phụ lục 6: Phổ hồng ngoại của 2- thienylethyl-/?-toluensulphonat
Phụ lục 7: Phổ hồng ngoại của (±)-methyl-2-(2-(thiophen-2-yl)ethylamino)-
2-(2-clorophenyl)acetat hydroclorid
Phụ lục 8:Phổ hồng ngoại của (±)-clopidogrel
Phụ lục 9: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của (±)ester methyl-2- clorophenylglycin
Phụ lục 10: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 2- thienylethyl-p- toluensulphonat
Phụ lục 11: Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân của (±)-methyl-2-(2-(thiophen-2- yl)ethylamino)-2-(2-clorophenyl)acetat hydroclorid
Phụ lục 12: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của clopidogrel racemic
Phụ lục 13: Phổ HPLC của clopidogrel racemic
Phụ lục 14: Phổ của clopidogrel racemic
t- I ý : i J ■-I SKLM của hợp chất ( 1 ) SKLM của hợp chất (2) SKLM của hợp chất (3) SKLM của hợp chất (4) SKLM của họp chất (5)