Tổng hợp Carbocystein từL-cystein hydroclorid monohydrat

2 .3.3.Xác định cấu trúc sản phẩm

3.1.1. Tổng hợp Carbocystein từL-cystein hydroclorid monohydrat

o

o

Quả trình phản ứng diễn ra như sau:

Trong bình cầu hai cổ lOOml, khuấy tạo huyền phù hỗn hợp gồm; 5g (20,8mmol) L-cystin, 25ml ethanol tuyệt đối và 8,5ml dung dịch HCl đặc. Sau đó, nâng nhiệt độ hỗn dịch đến 50°c, rồi cho từ từ 2a kẽm bột vào hỗn dịch để tiến hành phản ứng khử hóa. Sau khi cho hết kẽm, khối phản ứng được khuấy thêm 2h để phản ứng khử xảy ra hoàn toàn, kiểm tra lại bằng SKLM. Dịch phản ứng sau khi được lọc loại bỏ kẽm dư, được cất quay đến dịch đậm đặc. Sau đó thêm lOml THF khuấy đến đồng nhất. Thêm 5,6g natri acetat trihydrat vào khối phản ứng, khuấy 15 phút, sau đó làm lạnh để toàn bộ phức họp cysteinat tủa hết. Lọc thu lấy tủa phức hợp cysteinat.

Tạo huyền phù hỗn hợp gồm: Phức hợp cysteinat thu được ở trên, l,97gam acid monocloacetic, 6,7ml nước. Thêm dần dung dịch NaOH 6,7M cho tới khi dung dịch trong hoàn toàn. Khuấy thêm 5 phút. Sau đó điều chỉnh pH của dung dịch về 5 bằng acid acetic. Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h. Lọc loại tủa, thu lấy dịch lọc. Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2 bằng acid sulfuric đặc. Sau đó làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h. CMC (I) sẽ kết tinh dưới dạng muối nội. Lọc thu lấy tinh thể I. Hòa tan tinh thể I trong 200ml nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc. Dịch lọc được để kết tinh lạnh qua đêm. CMC sẽ kết tinh dưới dạng tinh thể trắng. Lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy ở 60°c. Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khoảng 204-211°C.

25

Quy trình có thể tóm tắt qua sơ đồ sau:

3.1.2.1. Khảo sát duns môi tao phức hơp cvsteinat

Quy trình tổng hợp CMC từ L-cystin được tiến hành qua hai giai đoạn:

- Giai đoạn 1 : Khử hóa L-cystin bằng tác nhân kẽm kim loại tạo L-cystein - Giai đoạn 2: Alkyl hóa L-cystein tạo CMC

Giai đoạn 1 ; Sử dụng kết quả nghiên cứu phản ứng khử hóa L-cystin bằng tác nhân kẽm [9].

Sau giai đoạn 1, để tiếp tục thực hiện giai đoạn 2, tiến hành tách thu lấy phức họp kẽm cysteinat natri trong các dung môi khác nhau.

Các dung môi được khảo sát là; Tetrahydrofuran (THF), nước cất, ethanol. Ket quả khảo sát được biểu diễn ở bản^ 3.7:

Bảng 3.7: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi tới hiệu suất tạo CMC

ST T Loại dung môi KL L-cystin (g) KLCM C (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 Tetrahydrofiiran l l l l l l l l l l i l l IMÊỀÊÊỈÊÊỄỄSBSẫỄKẵS-: 2 Nước cât 2,50 1,16 31,12

3 Ethanol tuyệt đôi 2,50 1,28 34,27

Nhận xét: Loại dung môi dùng để tủa phức họp cysteinat có ảnh hưỏng đến hiệu

suất phản ứng. Sử dụng dung môi THF cho hiệu suất phản ứng là cao nhất (37,28%). Do đó, dung môi THF được sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.

3.1.2.2. Khảo sát nhiêt đô phản ứng

Từ kết quả khảo sát dung môi dùng để tách lấy phức hçfp cysteinat và giai đoạn tinh chế, tiếp tục tiến hành khảo sát nhiệt độ thích hợp nhất cho phản ứng alkyl hóa.

Tiến hành phản ứng tại các nhiệt độ khác nhau: 10, 15, 20, 25, 30, 35°c.

27

Bàng 3.8: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng alkyl hóa

STT T ^ C f C ) KL L-cystìn (g) KL CMC (g) Hiệu suâtphản ứng (%)

1 10 2,5 2,19 58,65 2 15 2,5 2,44 65,34 3 2 0 2,5 2,55 68,41 4 2,5 73,12 5 30 2,5 2,49 66,74 6 35 2,5 2,47 66,25

Kết quả ở bảng 3.8 được biểu diễn ở đồ thị hình 3.5:

bũ

c3 G 3

Nhiet do phan ung (°C)

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất phản ứng tạo CMC

Nhận xét: Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng alkyl hóa. Ban đầu khi

tăng dần nhiệt độ lên (từ 10 đến 25°C) thì hiệu suất phản ứng tăng (từ 58,65% đến 73,12%). Sau đó, tăng tiếp nhiệt độ phản ứng (từ 25 đển 35°C) thì hiệu suất phản ứng giảm xuống (từ 73,12% xuống 66,25%). Do vậy, nhiệt độ thích họp cho phản ứng là 25°c.

3.1.2.3. Khảo sát thời gian tiến hành phản ứng

Sau khi tìm được nhiệt độ thích hợp cho phản ứng, tiếp tục tiến hành khảo sát thời gian phản ứng.

Tiến hành phản ứng ở các khoảng thời gian khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút Kết quả được trình bày trong bảng 3.9:

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng alkyl hóa

ST T Thòi gian phản ứng (phút) KL L-cystin (g) KLCM C (g) Hìêu suãt• phản ứng (%) 1 5 2,50 1,39 37,28 2 10 2,50 1,94 52,03 3 15 2,50 2,06 55,25 4 2 0 2,50 2,55 5 25 2,50 2,54 68,12 6 30 2,50 2,53 67,86

Kết quả ở bảng 3.9 được biểu diễn ở đồ thị hình 3.6:

bù C3 3 C p. 4—» 20 25 30

thoi gian phan ung (phut)

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thòi gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng tạo CMC

29

Nhận xét: Thời gian phản ứng alkyl hóa có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất phản ứng tạo CMC. Ban đầu, khi tăng dần thời gian phản ứng alkyl hóa lên gấp đôi (từ 5 phút đến 10 phút thì hiệu suất phản ứng tăng nhanh (từ 37,2% đến 52,03%). Sau đó, tiếp tục tăng dần thời gian phản ứng (từ 10 đến 15 đến 2 0 phút) thì hiệu suất phản ứng tăng dần (52,03% đến 55,25% và lên đến 68,39%). Sau đó, tăng tiếp thời gian phản ứng (25 đến 30 phút), hiệu suất phản ứng giảm nhẹ: từ 68,39% ở 20 phút xuống 68,12% ở 25 phút và 67,86% ở 30 phút. Như vậy, thời gian phản ứng thích hợp là 20 phút.

3.1.2.4. Khảo sát tỷ lê mol các chẩt tham gia phản ứng

Tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa L-cvstin và acid monocloacetic hiệu suất tạo CMC.

Kết quả thu được được biểu diễn ở bảng 3.10:

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol L-cystỉn và MCA tới hiệu suất tạo CMC

STT KL L-cystin (g) KL MCA (g) Tỷ lệ mol L- cystin và MCA Khôi lượng CMC (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 2,5 2,81 0,35 2,21 59,24 2 2,5 2,46 0,4 2,34 62,83 3 2,5 2,18 0,45 2,51 67,45 4 2,5 1,97 0,5 2,73 73,12 5 2,5 l l l l l i l l l l l 0,55 i l i l l l l i l l l 75,94 6 2,5 1,64 0,6 2,03 65,23 7 2,5 1,51 0,65 1,54 53,76 8 2,5 1,4 0,7 1,34 50,26

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol L-cystin và MCA đến hiệu suất phản ứng tạo CMC

Nhận xét; Qua kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.7 nhận thấy: tỷ lệ mol L-cystin và

acid monocloacetic có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phản ứng tạo CMC. Khi tăng tỷ lệ mol của L-cystin và acid monocloacetic từ 0,35 lên 0,55 thì hiệu suất phản ứng tăng đáng kể (từ 59,24 đến 75,94%). Khi tăng thêm tiếp tỷ lệ mol giữa L-cystin và acid monocloacetic thì hiệu suất phản ứng lại giảm xuống. Do đó tỷ lệ mol giữa L- cystin và MCA thích hợp là 0,55.

■=> Như vậy, qua kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp CMC từ L-cystin, các thông số cho quy trình phản ứng tốt nhất được trình bày ở bảng 3.11:

Bảng 3.11: Các thông sỗ tốt nhất cho quy trình phản ứng tổng hợp CMC Tỷ lệ mol L-

cystin và MCA

Dung môi thu phức hợp cysteinat Nhiệt độ phản ứng Thòi gian phản ứng Hiệu suất phản ứng 0,55 THF 25°c 2 0 phút 75,94 % r

31

Sản phẩm sau khi tổng hợp được, tiến hành kiểm ữa độ tinh khiết bằng hai phương pháp: SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Kết quả tìiu được như bảng 3.12 sau:

Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm CMC H ệ sô lưu g iũ R f Nhiệt độ nóng chảy fC ) CMC chuân(l) 0,24 206- 2i r c CMC tông hợp tìr L-CHM (2) # » ♦ 0,24 204,1-209,5"C CMC tổng hợp tò L-cystin (3) 0,24 206,3-21 l°c

^ Nhận xét: CMC tổng họrp được tìr hai nguồn nguyên liệu có cùng giá ttị Rf với CMC chuẩn và nhiệt độ nóng chảy cùng giá tìị nhiệt độ nóng chảy của CMC chuẩn.

3.3. Kết quả phân tích phổ của sản phẩm Carbocysteỉn

Để xác định cấu ữúc của chất tổng hợp được, chứng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton.

3.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoai

CMC được phân tích phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy GX- PerkinElmer- USA, đo trong vùng bước sóng 4000- 500 em'*.

Kết quả biện giải phổ được trình bày ở bảng 3.13 và phụ lục 1 và phụ lục 2

Bảng 3.13: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của CMC tổng hợp được

Nhóm ^ m a x (cin ) Mâu 1 (tông họp từL- CHM) Mâu 2 (tông hợp từ L- cystin) a-aminoacid 1511 (-NHs^), 1591 (>C0-) 1508 (-NHa^), 1591 (>C0-) -OH 2637; 2721 2646; 2723 > C = O a c , d 1687 1687

Nhận xét; Phân tích phổ đồ của sản phẩm cho phép nhận biết các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức: 2 nhóm chức acid carboxylic (-COOH), 1 nhóm amin (amino acid). Đây là các nhóm chức phù hợp với nhóm chức có trong công thức hợp chất tổng hợp được.

3.3.2. Phân tích phổ công hưởng từ hat nhân proton (*H-NMR)

Tiến hành phân tích cấu trúc chất tổng họp được bằng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ’H-NMR,

Dung môi được sử dụng: D2O (ở nhiệt độ cao).

Kết quả thu được ở bảng 3.14 và phụ lục 3, phụ lục 4, phụ lục 5 và phụ ỉục 6.

Bảng 3.14. Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của CMC tổng hợp được

Công thức cẩu tạo sản phẩm

ỗ (ppm) Mâu 1 (tông hợp từL-CHM) Mẩu 2 (tổng hợp từ L-cystin) 0 5 3 1 ì ^ ĩ 0 NH2 3,03 (IH, dd, C3- Ha) 3,03 (IH, dd, C3- Ha) 3,15 (IH, dd, C3- Hp) 3,15 (IH, dd, C3- H p) 3,38 (2H, s, C5-H2) 3,38 (2H, s, C5-H2) 3,92 (IH, dd, C2-H) 3,92 (IH, dd, C2-H)

(Ghi chú: dd; Doublet; s: Singlet)

Nhận xét: Ket quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của các

mẫu CMC cho thấy CMC tổng hợp được có cấu trúc như dự kiến.

3.4. Kiểm nuhìêm sản vhầm thu đươc theo môt số tiêu chuẩn BP 2009

3.4.1. Đinh tính CMC theo môt số tiêu chuẩn BP 2009

Định tính CMC thu được theo một số tiêu chuẩn BP 2009 thu được kết quả được trình bày ở bảng 3.15;

33

Bảng 3.15: Kết quả định tỉnh CMC theo một sổ tiêu chuẩn BP 2009

Yêu cầu chất lượng Phương pháp

tiến hành Kết quả

- Cảm quan, độ tan: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước lạnh và cồn, tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và dung dịch kiềm loãng

Quan sát - Bột kêt tinh trăng

- Không tan trong nước lạnh và các

dung môi hữu cơ (ethanol,

methanol, aceton...)

- Tan trong nước sôi, dung dịch acid, dung dịch kiềm

=>Đạt

Dung dịch S: Hòa tan 5,00 g CMC trong 20 ml nước và thêm vài giọt dung dịch NaOH đặc. Điều chỉnh đến pH 6,3 bàng dd NaOH IM rồi pha loãng với nước thành 50ml.

- Năng suât quay cực: dung địch s có [oc]ổ^= -32°5 đến - 35”5

Đo năng suât quay cực của dung dịch s

- [cc]ị^ = -33^

=>Đạt

- Phô hông ngoại Đo phô hông

ngoại của sản phẩm, so sánh với phổ chuẩn

- Theo kêt quả bảng 3.13 và phụ lục 3.1; 3.2

=> Đạt

-pH: Lăc 0,2g chê phâm với

2 0ml nước cất không chứa CO2. pH của hỗn dịch là 2,8- 3 Đo pH băng máy đo pH pH hỗn dịch: 3 =>Đạt

3.4.2. Đinh iương CMC theo tiêu chuẩn BP 2009 a. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ

Dung dịch chuẩn độ; Dung dịch HCIO4 0,1 M: Pha theo phụ lục 2.2 (Dược điển Việt Nam IV)

- Dung dịch chế phẩm: Hòa tan 0,150g chế phẩm CMC trong lOml acid forniic khan. Sau đó thêm 50ml dung dịch acid acetic băng. Làm 5 mẫu.

b. Chuẩn độ lại dung dịch H C I O 4 0,1M: Theo phụ lục 2.2 (Dược điển Việt Nam IV), sử dụng dung dịch chuẩn kali hydrophtalat trong acid acetic băng.

Làm với 3 mẫu, thu được kết quả:

Bảng 3.16: Kết quả chuẩn độ lại dung dịch acid HCIO4 0, IM

ST T Khôi lượng kali hydrophtalat (g)

Thê tích HCl0 4tại điêm tương đương (mỉ)

1 0,1044 5,05

2 0,1182 5J5

TB 0,1113 5,4

Hệ sô chuyên đôi của acid H C I O 4 là 0,02042 Hệ số hiệu chỉnh:

k = 0,1113 = 1,0094

0,02042 X 5,4

c. Tiến hành định lượng CMC theo tiêu chuẩn BP 2009 kết quả thu được như sau: Bảng 3.17: Kết quả định lượng CMC ST T Khôi lượng CMC(g) Thể tích HCl0 4Íại điểm tương đương (mỉ) Hàm lượng CMC (%) 1 0,1494 8,1950 99,20 2 0,1563 8,576 99,25 3 0,1537 8,45 99,44 4 0,1524 8,346 99,06 5 0,1577 8,72 1 0 0 , 0 2 Trung bình: 0,1539 8,4574 99,4 Với công thức tính là: ^ Khối lượng CMC là:

35

"=> Hàm lượng CMC có trong chế phẩm là:

m X 1000

Hàm lương CMC = ---- —---X 100% m l

Nhận xét; Sản phẩm CMC tổng hợp được đạt tiêu chuẩn về một số phép thử định

tính và định lượng theo tiêu chuẩn BP 2009

3.5. Bàn luân

3.5.1. Tổn£ hơp Carbocvstein từ L-cvstein hydrocỉorid monohydrat

Phản ứng tổng hợp CMC từ L-CHM thực hiện thuận lợi, có tính ổn định và đạt hiệu suất cao.

Trong quy trình tổng họp này, vấn đề kiểm soát nhiệt độ phản ứng đóne vai trò quan trọng. Khi nhiệt độ cao, trong môi trưòng kiềm L-cystein dễ bị oxy hóa thành L-cystin và làm hiệu suất phản ứng giảm mạnh.

Phản ứng oxy hóa L-cystein:

o [0] NaOH 'O H NH2 L-cystein

Nếu ở nhiệt độ quá thấp phản ứng xảy ra cũng không tốt. Do vậy, nhiệt độ thích hợp nhất là từ 17 đến 18°c.

Trong các thí nghiệm được thực hiện, ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng tạo CMC được thể hiện rõ, đặc biệt thời gian phản ứng có mối liên hệ với nhiệt độ phản ứng và tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng và tác nhân alkyl hóa. Khi nhiệt độ phản ứng nhỏ hơn 30°c thì thời gian phản ứng ảnh hưởng không nhiều đến hiệu suất phản ứng tạo CMC. Tuy nhiên, khi nhiệt độ phản ứng cao (>30°C) thì thời gian phản ứng càng lâu thì hiệu suất phản ứng càng thấp. Nguyên nhân là do, ở nhiệt độ càng cao, thời gian càng lâu thì lượng L-cystein bị oxy hóa tạo L-cystin càng nhiều.

Mặt khác, khi tỷ lệ mol L-CHM và MCA thấp (< 0,9) thì thời gian phản ứng càng lâu thì hiệu suất tạo CMC càng cao. Và khi tỷ lệ mol L-CHM và MCA cao (> 0,9) thì thời gian phản ứng ảnh huởng không nhiều đến hiệu suất phản ứng. Ảnh hưỏng của tỷ lệ mol L-CHM và MCA tới hiệu suất tạo CMC được phân tích rõ ràng trong mối quan hệ với thời gian phản ứng và nhiệt độ phản ứng alkyl hóa. Ban đầu, khi tăng dần tỷ lệ mol L-CHM và MCA (từ 0,5 đến 0,9) thì hiệu suất phản ứng tăng ở tất cả nhiệt độ. Nhưng khi tăng tiếp tỷ lệ mol hai chất lên lớn hơn 0,9 thì hiệu suất phản ứng thay đổi không nhiều với nhiệt độ nhỏ

hơn 30°c và giảm xuống với nhiệt độ lórn hơn 30°c.

Dựa vào các phần mềm thiết kế thí nshiệm MODDE 5.0 và phần mềm tối ưu hóa rNForm v3.1 đã tìm ra thông số tối ưu cho quy trình tổng hợp.

• Việc sử dụng các phần mềm tối ưu để tối ưu hóa cho quy trình tổng họp

là mới và rất cần thiết. So với cách khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng (như mục 3.1.2) thì việc sử dụng phần mềm tối ưu có nhiều ưu điểm vượt trội: o Các thí nghiệm được thiết kế một cách tự động dựa trên mặt họp tử tại tâm rút

gọn có tính khoa học và khách quan cao.

o Trong quá trình thiết kế thí nghiệm, các thí nghiệm tại tâm được lặp lại. Sai số của các thí nghiệm tại tâm được tính như sai số của toàn thí nghiệm nên kết quả phân tích có độ tin cậy cao.

■=> Có thể ứng dụng các phần mềm tối ưu hóa để triển khai nghiên cứu ở các quy mô lớn hơn.

o Với việc cùng phân tích ảnh hưỏmg của các yếu tố (nhiệt độ phản ứng, thời gian