2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
- Phân tích hình thái thực vật:
Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích [12].
Phân tích hoa theo phương pháp phân tích hoa [13] và chụp lại bằng máy ảnh. - Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
Đối chiếu mô tả với các tài liệu chuyên sâu: “Thực vật chí Trung Quốc” [25], “Cây cỏ Việt Nam” [8], “Thực vật chí Đông Dương” [28].
So sánh, đối chiếu với mẫu tiêu bản khô tại các phòng tiêu bản: Chinese Virtual Herbarium [35], Herbier Muséum Paris [37] và Royal Botanic Garden Kew [38].
Quan sát cấu tạo vi phẫu lá, cuống, thân bằng kính hiển vi theo phương pháp làm tiêu bản thực vật [12].
Quan sát bột lá bằng kính hiển vi theo phương pháp soi bột dược liệu [13]. Chụp ảnh các đặc điểm bằng máy ảnh.
- Làm tiêu bản mẫu khô bộ phận sinh dưỡng và sinh sản của cây theo phương pháp làm mẫu khô [12].
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính các nhóm chức hữu cơ thường có trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc hiệu và sắc kí lớp mỏng theo phương pháp ghi trong tài liệu “Bài giảng dược liệu tập 1” [14] và “Thực tập dược liệu - kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học” [13], bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội. Tiến hành định tính alcaloid trong dược liệu theo tài liệu “Nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học, một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt Nam” [9].
- Chiết xuất và chiết phân đoạn dịch chiết theo phương pháp chiết xuất dược liệu và ứng dụng các kỹ thuật sắc kí trong nghiên cứu hóa thực vật ghi trong dược liệu: “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [7], “Phương pháp nghiên cứu dược liệu” [1], “Bài giảng dược liệu tập 1” [14], cụ thể tiến hành theo sơ đồ hình 2.1.
2.3.2.1.Chiết xuất
Chiết rễ củ Cát sâm bằng phương pháp chiết ngấm kiệt: dược liệu được xay thành bột thô, sau đó được thấm ẩm bằng ethanol 96º để qua đêm. Chuyển toàn bộ lượng dược liệu này vào bình ngấm kiệt, tiến hành chiết với dung môi ethanol 960, thu dịch chiết ethanol [22], [23].
Cất thu hồi ethanol, đem cô tới khối lượng không đổi được cắn toàn phần (C1).
Lấy lượng cắn toàn phần phân tán trong nước cất. Chia dịch chiết nước làm 3 phần đều nhau, các phần dịch được kí hiệu lần lượt là phần A, phần B, phần C. Tiến hành xử lý các phần dịch chiết theo 3 cách khác nhau:
- Phần A: lọc tách riêng phần dung dịch và phần không tan. Phần dung dịch đem cô đến cắn (C2), phần không tan (C3) được rửa lại nhiều lần bằng nước cất [6 ]. - Phần B: lắc phân đoạn dịch chiết nước theo thứ tự với các dung môi: Ethyl
acetat, n-butanol. Dịch chiết các phân đoạn ethylacetat, n-butanol được cất thu hồi dung môi và cô cách thủy tới khi thu được 3 cắn được kí hiệu theo thứ tự là: C4, C5, C6 [22], [23].
- Phần C: lắc phân đoạn dịch chiết nước với các dung môi: n-hexan, dichloromethan, n-butanol. Dịch chiết các phân đoạn n-hexan, dichloromethan, n-butanol được cất thu hồi dung môi và cô cách thủy tới khi thu được 4 cắn được kí hiệu theo thứ tự là: C7, C8, C9, C10.
Các cắn C1, C2; C3; C4; C5; C6; C7; C8; C9; C10 được hòa tan lại bằng methanol sau đó được chấm SKLM trên cùng một bản mỏng để khảo sát chọn hệ dung môi khai triển thích hợp, đồng thời chọn phân đoạn thích hợp tạo tiền đề cho quá trình phân lập chất tinh khiết sau này. Tiến hành đưa mẫu lên bản mỏng bằng hệ thống phun bản mỏng Linomat 5. Tiến hành chạy sắc ký bằng hệ thống khai triển bản mỏng ADC2 với các 7 hệ dung môi pha động khác nhau. Các hệ pha động khảo sát là:
Chloroform : Methanol (9:1) (Hệ I)
Chloroform : Methanol (8:2) (Hệ II)
Chloroform : Methanol (7:3) (Hệ III) [6]
Dichloromethan : Methanol : Acid acetic (10 : 2 : 0,1) (Hệ IV)
Chloroform : Methanol : Ethyl acetat : Nước (16,2 : 18,8 : 52 : 3) (Hệ V) [2]
Chloroform : Methanol : Nước (7 : 2,5 : 0,25) (Hệ VI) [2], [6]
Chloroform : Ethanol (3:1) (Hệ VII) [14], [6]
So sánh các cắn về hiệu lực tách, số lượng vết qua quan sát SKĐ dưới các bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm và hình ảnh pick sắc kí để chọn hệ pha động
tốt nhất. Số lượng vết tách được phát hiện bởi phần mềm Video Scan dựa trên SKĐ bản mỏng khai triển chụp dưới bước sóng UV 254 nm.
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất và chiết PĐ dịch chiết củ Cát sâm Bột DL thô DC cồn C1 DC nước PĐ n-hexan n-butanol DC nước Ethyl acetat Dichloromethan n-butanol Cất thu hồi Cồn 960, chiết ngấm kiệt
Phân tán trong nước
n-hexan PĐ dichloromethan DC nước PĐ n-butanol PĐ EtOAc PĐ n-butanol C6 C10 Phần B Phần C Cô tớicắn C4 C5 Cô tới cắn Cô tới cắn C7 C9 C8 Cô tới cắn Cô tớicắn Cô tới cắn Dung dịch Lọc tách riêng phần không tan Phần không tan (C3) C2 Cô tới cắn Phần A