5. Điểm mới của đề tài
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập đƣợc xác định là vi khuẩn
Gluconacetobacter BNH2 đƣợc cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 300C. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4o
C dùng cho các nghiêng cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần.
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật
cho quá trình liên men. Phƣơng pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng trong 20 phút. Sau đó đem sử lý trong đèn cực tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào nuôi lắc 130 vòng/ phút trong 24h.
2.2.1.3. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trƣờng lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh caramen đƣờng. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trƣờng 10% giống hoạt hóa.
Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Khoảng sau 5 ngày thì có thể thu đƣợc màng.
2.2.1.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi lên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm gram:
Tím gentian: 2 phút Rửa nƣớc Dung dịch lugol: 2 phút Rửa nƣớc Cồn 950: 20 giây Rửa nƣớc Dung dịch fucshin: 2 phút Rửa nƣớc
Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn
Sau đó soi trên tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng, đó là vi khuẩn
2.2.2. Phương pháp vật lý
Nghiên cứu khả năng thấm hút màng của màng BC đối với nƣớc và các chất phụ gia: Nƣớc muối sinh lý, kháng sinh Berberin clorid 0,1%, , cao đặc lá sim (Rhodomyrtus tomentosa), tinh dầu nghệ (Rhizoma curcumae longa).
Cách tiến hành: Màng BC sau khi đƣợc xử lý sẽ cân khối lƣợng màng ban đầu m1. Sau đó, màng đƣợc ngâm trong dung dịch có chứa chất phụ gia hòa tan, cân màng ở các khoảng thời gian: 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ đƣợc khối lƣợng m2.
Khảo sát khả năng thấm hút của màng đối với các chất phụ gia qua công thức sau: M = m1 - m2
Trong đó M: Khối lƣợng chất phụ gia hút đƣợc [15].
Chúng tôi tiến hành cùng một lúc với 3 mẫu màng có diện tích tƣơng tự nhau. Thống kê và xử lý kết quả theo phƣơng pháp 2.2.5 để tính đƣợc khối lƣợng dung dịch chất phụ gia mà màng hút đƣợc: M(g)/cm2
.
2.2.3. Phương pháp xử lý màng BC từ Gluconacetobacter
Màng BC sau khi đƣợc hình thành trên môi trƣờng dịch thể ở ngày thứ 5 trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ thu hoạch trong box cấy vô trùng. Màng BC lúc này đƣợc gọi là màng dạng thô, còn chứa khá nhiều thành phần dƣ của môi trƣờng bám vào nên mục đích của quá trình xử lý màng là loại bớt các sản phẩm dƣ , giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt đƣợc hiệu quả về mặt cảm quan: Màu trắng trong, dai và bền hơn... Song màng chúng tôi nghiên cứu chủ yếu đƣợc ứng sản xuất ở quy mô công nghiệp, vì vậy các bƣớc xử lý màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi tiến hành thử khả năng ngăn cản vi sinh vật và một số đặc điểm của màng đƣợc xử lý cần đạt độ pH trung tính, màu sắc phù hợp, màng có khả năng thấm hút tốt.
Bảng 2.1. Các bƣớc xử lý màng sau lên men
STT Các bƣớc xử lý Kết quả
1 Rửa lại bằng nƣớc máy nhiều lần
Loại bỏ bớt acid acetic và các thành phần dƣ thừa từ môi trƣờng, màng có màu vàng, mùi hơi chua
2
- Ngâm màng BC trong dung dịch muối NaCl 0,7N, trong 12 giờ
- Rửa nƣớc và đun sôi 3 lần
- Làm chết và sạch vi khuẩn.
- Loại bớt muối và chất dƣ thừa
3
- Cho màng BC vào dung dịch NaOH 0,5N tới khi màng chuyển sang màu trắng trong.
- Rửa lại bằng nƣớc máy nhiều lần
- Loại bỏ chất dƣ thừa, làm trắng màng, kiềm hóa bề mặt sợi
cellulose. Màng có màu trắng trong, mùi khét, giảm độ cứng và dai. - Giảm bớt nồng độ kiềm
4
Trung hòa bằng acid citric loãng và kiểm tra pH, rửa sạch lại nhiều lần bằng nƣớc máy.
Màng có màu trắng đục và có mùi kiềm.
5
- Ngâm trong cồn 700 , kiểm tra nếu còn
kiềm tiếp thì lại tiếp tục trung hòa. - Rửa nƣớc và đun sôi màng 3 lần, mỗi lần đung sôi từ 2 - 3 phút.
- Kiềm dƣ sẽ tan trong cồn, sau khi trung hòa pH: 7
- Loại bỏ bớt muối natri acetat, các chất dƣ thừa. Màng trắng, hơi đục và không có mùi.
2.2.4. Phương thức đóng gói màng BC
2.2.4.1. Đóng gói bằng phương pháp thủ công
Vật liệu đóng gói: Túi nilon thông dụng đã đƣợc hấp thanh trùng.
Phương pháp đóng gói: Làm kín miệng túi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Màng BC sau khi đƣợc đóng gói bằng phƣơng pháp này đƣợc chiếu xạ UV trong 30 phút, rồi đƣợc bảo quản, theo dõi trong điều kiện bình thƣờng.
2.2.4.2. Đóng gói bằng máy hút chân không
Vật liệu đóng gói: Là túi hút chân không chuyên dụng.
Phương pháp đóng gói là: Đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không chuyên dụng AMERA V100.
Theo dõi màng BC và ghi kết quả.
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng:
M = S n Hệ số biến thiên: Cv = S X x 100% Trong đó: n: Số lần nhắc lại Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lên men và thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter trên quy mô phòng thí nghiệm
3.1.1. Lên men tạo màng BC
Kết quả quá trình lên men tạo màng đƣợc nghiên cứu từ chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BNH2, chủng vi khuẩn này đƣợc phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa Sinh - KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 cung cấp. Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đã đƣợc một số tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Trần Nhƣ Quỳnh, Nguyễn Thị Thùy Vân [13], [14] tiến hành nghiên cứu về khả năng lên men tạo màng. Tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn
Gluconacetobacter thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter
Khi tiến hành nhuộm Gram thì vi khuẩn Gluconacetobacter BNH2 bắt màu hồng của thuốc nhuộm, và Gluconacetobacter BNH2 là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử.
Kết quả nhuộm Gram đều trùng hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Trần Nhƣ Quỳnh, Nguyễn Thị Thùy Vân [13], [14].
Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men tạo màng BC theo 4 bƣớc cơ bản nhƣ sau:
Bước 1. Chuẩn bị giống
Nhận giống Gluconacetobacter BNH2 thuần chủng từ phòng thí nghiệm Vi sinh, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2.
Tiến hành nhân giống bằng phƣơng pháp cấy truyền:
Hình 3.2. Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng
Giống Gluconacetobacter đƣợc bảo quản trên môi trƣờng thạch nghiêng và tiến hành giữ giống, nhân giống bằng phƣơng pháp cấy truyền chuẩn bị để nhân giống cấp 1 trong môi trƣờng nuôi lắc bằng máy lắc nhiệt.
Bước 2. Nhân giống cấp 1
Giống thuần cấy vào môi trƣờng nhân giống cấp 1 (1 ống giống / 200ml môi trƣờng giống), nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt (350
C, lắc 169 vòng / phút trong 24 giờ).
Trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng sợi nhỏ với kích thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
Bước 3. Lên men tạo màng (nhân giống cấp 2)
Dùng pipep man cấy dịch cấp 1 vào môi trƣờng lên men nhân giống cấp 2 (20ml dịch cấp 1/ 200ml môi trƣờng).
Tiến hành lên men tĩnh trong 5 ngày để tạo màng
Hình 3.4. Lên men tĩnh trong 5 ngày
Vi khuẩn Gluconacetobacter nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện tĩnh, sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào sảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dƣỡng, tạo thành một lớp màng nổi trên bề mặt môi trƣờng dịch thể.
Bước 4: Thu màng
Với mục đích thu nhận màng BC, chúng tôi tiến hành cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BNH2 trên môi trƣờng dịch thể, thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng đã đƣợc tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân [18] nghiên cứu
và sử dụng để nuôi cấy lên màng hiệu quả, trong điều kiện tĩnh, ở nhiệt độ phòng (280 - 300C ), sau 4 -5 ngày tiến hành thu màng. Kết quả thể hiện ở hình sau:
Hình 3.5. Màng BC sau 5 ngày lên men
Quan sát quá trình lên men xảy ra trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, khi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter vào môi trƣờng, ban đầu trong môi trƣờng lên men sẽ xuất hiện các sợi cellulose lơ lửng tập chung dƣới đáy môi trƣờng, đồng thời dung dịch lên men đục dần. Sau đó, màng cellulose tạo thành nổi lên trên bề mặt của môi trƣờng. Sau 5 ngày tiến hành thu màng, quan sát thấy màng có đặc điểm mỏng đồng nhất, có màu trắng, dai nhẵn. Nếu để thời gian quá lâu, khoảng 6 ngày thấy hiện tƣợng màng chìm dần xuống đáy, khả năng tạo màng kém dần, chất lƣợng màng giảm.
Kết quả lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trên cũng phù hợp với kết quả lên men tạo màng của tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Trần Nhƣ Quỳnh, Nguyễn Thị Thùy Vân [14], [15], màng thu đƣợc có nhiều đặc tính tốt phù hợp với mục đích tạo màng trị bỏng, chính vì vậy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter phù hợp với mục đích nghiên cứu, do đó chúng tôi quyết định chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter để lên men tạo màng BC.
3.1.2. Xử lý màng BC sau lên men
Màng BC sau khi tiến hành vớt ra khỏi dịch lên men đƣợc xử lý theo phƣơng pháp 2.2.3 với mục đích là loại bớt các sản phẩm dƣ thừa, giảm độ pH, làm sạch vi khuẩn đồng thời phần nào giúp màng đạt đƣợc hiệu quả về mặt cảm quan. Cụ thể ở bảng sau:
Bảng 3.1. Đặc điểm của màng sau khi xử lý
STT Đặc điểm của màng Kết quả
1 Màu sắc màng Trắng trong
2 Mùi vị Mùi thơm của nƣớc dừa
3 Độ dai Dai
4 Độ pH của màng 5
Hình 3.6. Màng BC sau xử lý
Màng BC sau xử lý bƣớc đầu để đáp ứng đƣợc các chỉ tiêu của vật liệu sử dụng trong điều trị bỏng cần có các tiêu chí sau:
Khả năng thấm hút tốt, hút đƣợc dịch trên vết thƣơng
Không độc không gây dị ứng , không gây đáp ứng miễn dịch.
Vô khuẩn, đƣợc khử trùng diệt khuẩn và không mang mầm bệnh đến cho vết thƣơng.
Nhƣ vậy, màng BC đƣợc tạo ra từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
cần trải qua 2 quá trình là lên men và tạo màng. Sau quá trình thu màng thì màng BC sẽ đƣợc đƣa vào xử lý để đạt đƣợc những yêu cầu về mặt vật lý và tiến hành bảo quản ngay sau khi xử lý màng để không làm thay đổi tính chất của màng BC.
3.2. Lựa chọn phƣơng thức đóng gói màng BC
Trong quá trình nghiên cứu để tìm ra phƣơng thức đóng gói màng BC có hiệu quả cao nhất và chất lƣợng màng tốt nhất không bị thay đổi đặc tính cần phải tiến hành đóng gói ngay sau khi tiến hành xử lý hết tạp chất lẫn trong màng. Theo kết quả nghiên cứu của sinh viên Trần Thị Hậu (2012) [7] tiến hành đóng gói màng BC theo hai phƣơng pháp là đóng gói thủ công và đóng gói bằng máy hút chân không chuyên dụng. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở mục 3.2.1 và 3.2.2 .
3.2.1. Đóng gói bằng phương pháp thủ công
Vật liệu đóng gói: Là túi nilon thông dụng đã đƣợc hấp vô trùng
Phương pháp đóng gói: Làm kín miệng túi bằng nhiệt hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Hình 3.8. Đóng gói màng BC trên ngọn lửa đèn cồn
Túi nilon đem hấp vô trùng, sau đó màng BC đã sấy và túi nilon đƣợc chiếu xạ UV 15 phút rồi đem đóng gói bàng cách làm kín miệng túi bằng đèn cồn.
Hình 3.9. Màng BC đóng gói thủ công
Màng BC đƣợc đóng gói bằng phƣơng pháp thủ công đƣợc bảo quản và theo dõi ở điều kiện môi trƣờng bình thƣờng. Kết quả sau 7 ngày: Trên bề mặt của màng thấy một số nấm mốc xuất hiện.
Hình 3.10. Nấm mốc xuất hiện trên bề mặt màng
Bảng 3.2. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng gói thủ công
Ngày 1 3 5 7
Xuất hiện VSV - - + +
Xuất hiện : + Không xuất hiện: - Ưu và nhược điểm của phương pháp đóng gói thủ công:
Ưu điểm: Vật liệu dễ kiếm, giá thành rẻ, thao tác đơn giản, dễ thực hiện.
Nhược điểm: Không đáp ứng yêu cầu bảo quản màng trong một thời gian dài, màng dễ bị nhiễm khuẩn.
Vì vậy phƣơng pháp này không khả thi, không đáp ứng đƣợc yêu cầu bảo quản màng BC, ứng dụng điều trị bỏng.
3.2.2. Đóng gói bằng máy hút chân không
Vật liệu đóng gói: Là máy hút chân không chuyên dụng AMERA V100, túi nilon dùng cho máy hút chân không (15×20cm).
Phương pháp đóng gói: Đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không chuyên dụng AMERA V100.
Hình 3.11. Máy chân không và túi hút chân không
Màng BC đƣợc hấp vô trùng sau đó tiến hành sấy ở 500c và đƣợc chiếu xạ tia UV trong 15 phút rồi đóng gói chế phẩm màng trong các túi trong các túi nilon nhờ máy hút chân không trong box cấy. Các thao tác đều phải đảm bảo vô trùng.
Tiến hành theo dõi màng BC đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không trong 30 ngày thì thấy: Trên bề mặt màng không xuất hiện nấm mốc và khuẩn lạc.
Bảng 3.3. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật với màng BC đóng gói bằng máy hút chân không
Ngày 1 3 5 7 14 30
Xuất hiện vsv
- - - - - -
Xuất hiện: + Không xuất hiện: -
Hình 3.12. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không
Ưu và nhược điểm của phương pháp đóng gói bằng máy hút chân không: Ưu điểm: Thao tác không phức tạp, bảo quản đƣợc màng BC trong một khoảng thời gian dài.
Nhược điểm: Phải đầu tƣ máy và vật liệu đóng hút chân không chuyên dụng.
Phƣơng pháp đóng gói bằng máy hút chân không tối ƣu hơn so với phƣơng pháp đóng gói thủ công màng BC đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không có khả năng bảo quản màng BC đƣợc lâu hơn phƣơng pháp thông thƣờng. Nhƣ vậy phƣơng pháp đóng gói bằng máy hút chân không phù hợp với đóng gói màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm.
Phƣơng pháp đóng gói bằng máy hút chân không hoàn toàn đem lại hiệu quả bảo quản màng BC cao và không làm thay đổi tính chất của màng, kết quả nghiên cứu này cũng hoàn toàn trùng khớp với kết quả nghiên cứu của sinh viên Trần Thị Hậu (2012) [7].
3.3. Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC và hoàn thiện quy trình