Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.

- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.

Hơn nữa, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương pháp này là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.

Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết hợp

khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật

Mẫu cây Rù rì (Homonoia riparia) thu tại vườn Quốc gia Tam Đảo

vào tháng 3 năm 2011 và được PGS.TS. Ninh Khắc Bản, Viện Hóa sinh biển giám định. Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.2 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430

mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical

Ltd.).

2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Được tiến hành trên hệ thống Agilent 1200. Cột sắc ký sử dụng J'sphere H80 20mm x 150 hoặc J's phere ODS -H80 20 mm x 250 mm, tốc độ dòng 4 ml/phút, hệ dung môi sử dụng là axetonitril/nước hoặc metanol/nước.

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển.

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): (1H, 400 MHz; 13C, 100 MHz)

đo trên máy VARIANT 400-MR tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4. Độ quay cực []D

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4. Dụng cụ và thiết bị

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:

+ Bình chiết + Micropipet

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 365 nm + Máy sấy

+ Tủ sấy chân không + Máy cô quay chân không

+ Cột sắc ký pha ngược trung áp + Máy phun dung dịch thuốc thử + Bếp điện

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc

+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân Variane 400-MR spectrometer.

+ Máy sắc ký lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC-

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage.

2.5. Hoá chất

+ Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.

+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltg). + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715). + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).

+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck). + Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, chloroform, ethyl acetate, chloroform, hexane, acetone, v.v… là loại hóa chất tinh khiết của Merck.

CHƯƠNG 3:

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Xử lý mẫu

Lá cây Rù rì được phơi khô, nghiền thành bột (8,0 kg).

3.2.Phân lập các chất

Lá cây Rù rì được phơi khô, nghiền thành bột (8,0 kg), ngâm chiết với metanol ba lần, thu được 700,0 g cặn chiết metanol.

Cặn metanol được hoà tan vào 2 lít nước cất, chiết lần lượt bằng hexan và etylaxeat. Sau khi đuổi dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn hexan (20,0 g), etylaxetat (254,0 g) và dịch nước (260,0 g).

Dịch nước được đưa lên cột diaion, loại muối vô cơ bằng nước cất rồi tiến hành chạy gradient metanol trong nước (0, 25, 50, 75 và 100%) thu được 6 phân đoạn HR1 (11 g), HR2 (31 g), HR3 (132 g), HR4 (10 g), HR5 (2,5 g) và HR6 (1 g). Phân đoạn HR4 được hòa tan trong lượng clorofoc tối thiểu, sau đó tẩm vào silica gel, cô loại dung môi cho đến khi bột tơi, khô. Sau đó chuẩn bị cột nhồi silicagel pha thường cỡ hạt 230-400 mesh (0,04-0,063 mm) và nạp mẫu khô vào cột và rửa giải với hệ dung môi clorofoc/metanol với độ phân cựctăng dần từ (10/1, v/v) thu được 3 phân đoạn HR4A (1 g), HR4B (0,25 g) và HR4C (0,8 g). Phân đoạn HR4B được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột J's phere ODS -H80 20 mm x 250 mm, tốc độ dòng 4 ml/phút, hệ dung môi sử dụng là metanol/nước tỉ lệ 41/59 thu được hợp chất 1 (14,1 mg), hợp chất 2 (4,1 mg).

SKL hiệu năng cao (HPLC)

Sơ đồ 3.1: Phân lập hợp chất từ lá cây Rù rì

Cột Diaion Metanol/nước Bột khô (8kg) HR4 10 g HR5 2,5 g HR6 1 g Cặn n-hexan (20g) Cặn MeOH 700g Cặn etyl axetat (254g) HR1 11 g HR3 132g HR2 31 g Dịch nước (260g) (1) 14,1 mg (2) 4,1mg HR4A 1 g HR4B 0,25g HR4C 0,8 g n-hexan etylaxetat Chiết MeOH 3 lần Clorofoc/ metanol 3:1 Cột sắc ký pha thường

3.3.Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất[10,11]

3.3.1. Hợp chất 1: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside:

Tinh thể màu vàng, công thức phân tử C21H20O12, M = 460.

Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) (ppm): 6.19 (1H, s, H-6); 6.38 (1H, s, H-8); 7.70 (1H, d, J= H-2′,); 5.25 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1′′); 3.47 (1H, d, J = 7.2, 8.0 Hz, H-2′′); 3.41(1H, t, J = 8.0 Hz, H-3′′); 3.21 (1H, m, H-4′′); 3.55 (1H, dd, J= 5.6, 11.4 Hz, H-6′′) và 3.70 (1H, dd, J =2.4, 11.0 Hz, H-6′′). Phổ 13C-NMR: C 158.99 (C-2), 135.60 (C-3), 179.49 (C-4), 163.06 (C-5), 99.68 (C-6), 166.01 (C-7), (C-8), 158.46 (C-9) và 105.68 (C-10)] còn 6 cacbon của 1 phân tử đường (C 104.6, 75.72, 78.10, 78.40, 71.20 và 62.5).

3.3.2. Hợp chất 2: Quercetin 3-O-β-D-(6″-galloyl) glucopyranoside:

Tinh thể màu vàng, công thức phân tử C28H24O16, M = 616.

Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) (ppm): 6.16 (1H, s, H-6), 6.32 (1H, s, H-8), 7.53 (1H, s, H-2′,), 5.20 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1′′), 3.46 (1H, t, J = 8.0Hz, H-3′′), 3.45 (1H, m, H-4′′), 3.47(2H, dd, J = 7.2, 8.0 Hz, H-2″,H-5′′), và 4.26 (1H, d, J= 11.4 Hz, H-6″); 4.34 (1h, d, J= 11.4 Hz, H-6″; 6.93 (2H, s, H-2"', H-6"'). Phổ 13C-NMR: [C 159.32(C-2), 135.30 (C-3), 179.33 (C-4), 162.82 (C-5), 99.91 (C-6), 165.89 (C-7), 94.83 (C-8), 158.33 (C-9) và 105.52 (C-10)]

còn 6 cacbon của 1 phân tử đường (C 104.24, 75.66, 78.01, 71.42, 75.83 và 64.30).

CHƯƠNG4:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất1

Hợp chất 1 phân lập được dưới dạng tinh thể màu vàng. Phổ NMR của

hợp chất 1 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho cấu trúc dạng flavonoit chứa đường. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó 1 cặp proton được xác định ở vị trí meta với nhau tại H

6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz) và H 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz) đặc trưng cho proton vòng A tại vị trí C-6 và C-8; 1 proton tại H 7.70 (1H, d, J=2.0 Hz) đặc trưng

cho vị trí C-2′; 1 proton tại H 6.85 (1H, d, J= 8.0); 1 proton tại H 7.57 ( 1H, dd, J= 2.0, 8.0 Hz) của vòng B. Những tín hiệu proton này gợi ý hợp chất 1có cấu trúc khung dạng quercetin. Sự xuất hiện các proton anome tại H 5.25 (d, J

= 7.2 Hz) xác định sự tồn tại của một phân tử đường. Ngoài ra, sự xuất hiện tín hiệu của một nhóm oximetilen tại H 3.55 (1, H d, J =5.6, 1.,4 Hz)/3.70 (1H, dd, J = 2.4, 11.4Hz)

Hình 4.1.1. Phổ 1H- NMR của hợp chất 1

Trên phổ 13C-NMR củahợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 21 cacbon, ngoài 15 cacbon thuộc khung flavonoit C 158.99 (C-2), 134.83 (C-3), 179.49 (C-4), 163.06(C-5), 99.84 (C-6), 166.10 (C-7), 94.90 (C-8), 156.60 (C-9) và 104.90 (C-10)còn 6 cacbon của 1 phân tử đường (C 104.26, 75.72, 78.10, 78.40, 71.20 và 62.52) và còn cùng với giá trị hằng số tương tác của proton anome tương ứng [H 5.25 (1H, d, J = 7,2 Hz)] cho phép dự đoán sự có mặt của 1phân tử đường O-β-D-glucopyranoside. So sánh các dữ liệu vừa trình bày của hợp chât 1 với hợp chất đã được công bố trên thế giới qua bảng 4.1 là gần trùng khớp xác định hợp chất 1 là chất quercetin-3-O-β-D- glucopyranoside[3].

Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

Từ các kết quả phân tích phổ được nêu ở trên hợp chất 1 đượckhẳng định tìm thấy bằng quá trình phân lập hợp chất từ cây Homonoia riparia.

O O OH HO O OH OH 2 3 4 5 7 3' 4' O HO HO HO 2'' 3'' 4'' 5'' OH 6'' Hợp chất 1: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside

Bảng 4.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1[10] C δC (*) δC δH Aglycone 2 158.2 158.99 - 3 135.4 135.60 - 4 179.2 179.49 - 5 162.7 163.06 - 6 99.8 99.86 6.19 (d, 2.0) 7 165.7 166.01 - 8 99.6 94.68 6.38 (d, 2.0) 9 158.8 158.46 - 10 105.5 105.68 - 1' 123.1 123.06 - 2' 115.8 115.99 7.70 (d, 2.0) 3' 145.6 145.90 - 4' 149.6 149.84 - 5' 117.5 117.53 6.85 (d, 8.0) 6' 122.8 123.18 7.57 (dd, 2.0, 8.0) 3-O-Glc 1'' 104.2 104.26 5.25 (d, 7.2) 2'' 75.6 75.72 3.47 (d, 7.2, 8.0) 3'' 78.2 78.10 3.41 (t, 8.0) 4'' 71.1 78.40 3.21 (m)

6″ 62.4 62.52 3.55 (dd, 5.6, 11.4) 3.70 (dd, 2.4, 11.4)

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2

Hợp chất 2 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng. Dữ liệu phổ NMR

của hợp chất 2 khá giống với hợp chất 1 với các tín hiệu đặc trưng của cấu trúc flavonoit chứa đường. Trên phổ 1H- NMR của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó có 1 cặp proton được xác định ở vị trí meta với nhau tại H 6.16(1H, d, J = 2.0 Hz) và H 6.32 (1H, d, J = 2.0 Hz) đặc trưng cho proton vòng A tại vị trí C-6 và C-8; 1 proton tại H 7.53 (1H, d, J=2.0

Hz) đặc trưng cho vị trí C-2′; 1 proton tại H 6.7 (1H, d, J= 8.4); 1 proton tại H 7.55 ( 1H, dd, J= 8.4) của vòng B. Những tín hiệu proton này gợi ý hợp chất2

có cấu trúc khung dạng quercetin. Sự xuất hiện các proton anome tại H 5.20 (1H, d, J = 7.2 Hz) xác định sự tồn tại của một phân tử đường. Ngoài ra, sự xuất hiện tín hiệu của một nhóm galloyl tại H 4.26(1H, d, J = 11.4 Hz)/4.34 (1H, dd, J = 11.4 Hz). Và hai tín hiệu proton vòng thơm giống nhau đặc trưng cho proton vòng C tại vị trí C-2″′ và C-6″′H 6.93(1H, d, J=2.0Hz).

Hình 4.2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2

Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu của 26 cacbon, ngoài 15 cacbon thuộc khung flavonoit [C 159.32(C-2), 135.30 (C-3), 179.33 (C-4), 162.82 (C-5), 99.91 (C-6), 165.89 (C-7), 94.83 (C-8), 158.33 (C-9) và 105.52 (C-10)] còn 6 cacbon của 1 phân tử đường (C 104.26, 75.66, 78.01, 71.42, 75.83, và 64.30) cùng với giá trị hằng số tương tác của proton anome tương ứng [H 5.20 (1H, d, J = 7.5 Hz)] cho phép dự đoán sự có mặt của đường O-β-D-glucopyranoside ngoài ra còn có 6 tín hiệu cacbon của vòng thơm (C 123.0, 110.12, 146.27, 139.71, 146.27, 110.12) với 1 cacbon đính với vòng thơm (C168.17).Từ những dữ kiện phổ trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ 13C-NMR củaquercetin 3-O-β-D-(6″-galloyl)glucopyranoside, các phổ proton được gán với các số liệu cacbon tương ứng thông qua phổ HSQC, kết quả chi tiết này được trình bày trong hình 4.1.8. Thông qua các tương tác

gán với các proton tương ứng. Cácproton tại H 6.16 (1H) có tương tác với cacbon có C 99.91vàH6.32 (1H) có tương tác với cacbon tại C94.83, proton H (1H) có tương tác với cacbon có C 117.19. Proton tại H 4.26 (d, 11.4) và

4.34 (d, 11.4) cùng có tương tác với cacbon tại C 64.30 chứng tỏ sự tồn tại

của nhóm cacboxylic đính tại vị trí C-6″.[8]

Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất 2

Cấu trúc của hợp chất 2 được khẳng định thêmqua các tương tác

HMBC.Các tương tác HMBC giữa H-1″ (H 5.20) với C-3 (C 135.30); Giữa

H-6″ (C4.26; 4.34) với C-5″ (C75.83) và C-7′″(C168.17) khẳng định có một phần từ đường đính tại C-3 và nhóm 6″-galloyl đính với phân tử đường tại C- 5″.

Hình 4.2.5. Phổ HMBC của hợp chất 2

Từ các kết quả phân tích phổ nêu trên hợp chất 2được khẳng định tìm thấy bằng quá trình phân lậphợp chất từ cây Homonoia riparia

O O OH HO O OH OH 2 3 4 5 7 3' 4' O O HO HO 2'' 3'' 4'' 5'' OH O HO HO 5 6'' 1''' 3''' 4''' 7''' HO Hợp chất 2: Quercetin 3-O-β-D-(6″-galloyl)glucopyranoside CTPT: C28H24O16 KLPT: 616

Bảng 4.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2[11] C δC (*) δC δH Aglycone 2 156.4 159.32 - 3 133.4 135.30 - 4 177.4 179.33 - 5 161.3 162.82 - 6 98.8 99.91 6.16 (s) 7 164.3 165.89 - 8 93.7 94.83 6.32 (s) 9 156.5 158.33 - 10 104.0 105.52 - 1' 121.1 121.21 - 2' 115.4 117.19 7.53 (s) 3' 144.9 145.74 - 4' 148.5 149.68 - 5' 115.8 115.91 6.70 (d, 8.4) 6' 122.0 123.56 7.55 (d, 8.4) 3-O-Glc 1'' 101.4 104.24 5.20 (d, 7.2) 2'' 74.1 75.66 3.47 3'' 76.4 78.01 3.46 4'' 69.6 71.42 3.45 5'' 74.2 75.83 3.47 6'' 63.2 64.30 4.26 (d, 11.4) 4.34 (d, 11.4)

6″-O-Gal 1''' 119.4 123.00 - 2''' 108.7 110.12 6.93 (s) 3''' 145.5 146.27 - 4''' 138.5 139.71 - 5''' 145.5 146.27 - 6''' 108.7 110.12 6.93 (s) 7''' 165.8 168.17 -

KẾT LUẬN

Khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học cây Rù rì” đã hoàn thành với kết quả như sau:

1. Đã sử dụng các phương pháp sắc ký phân lập được hai hợp chất từ dịch chiết metanol lá cây Rù rì (Homonoia riparia)

Hợp chất 1:Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside

Hợp chất 2:Quercetin 3-O-β-D-(6″-galloyl)glucopyranoside

2. Bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các dữ liệu phổ đã được công bố, xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất 1 và hợp chất 2 như sau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tập I, trang 875-876 (2004).

2. Võ Văn Chi, 1999. Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội,

tr. 471.

3. Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and

flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976).

4. Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 (1994).

5. Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic

indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york, (1970).

6. Yang S. M, Liu X. K., Qing C., Wu D. G., Zhu D. Y,. Chemical constituents from the roots of Homonoia riparia.Yao Xue Xue Bao., 42(3), 292-296 (2007).

7. Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986,

Chaprman & Hall, (1994).

8. Kadota, Shigetoshi; Takamori, Yasushi; Khin, NyeinNyein; Kikuchi, Tohru; Tanaka, Ken; Ekimoto, Hisao. Constituents of the leaves of WoodfordiafruticosaKurz. I. Isolation, structure, and proton and carbon-13 nuclear magnetic resonance signal assignments of woodfruticosin (woodfordin C), an inhibitor of deoxyribonucleic acid