Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay.Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác đ nh cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và 13C dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ d ch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác đ nh dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
2.3.3.1. Phổ 1
H-NMR
Trong phổ 1
H-NMR độ d ch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác đ nh trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng của độ d ch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác đ nh được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
2.3.3.2. Phổ 13
C-NMR
Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13
C- NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230 ppm.
2.3.3.3. Phổ DEPT
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900
chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
2.3.3.4. Phổ 2D - NMR
Đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác đ nh tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác đ nh nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ một là trục phổ 1
H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ COSY (Chemical Shiff Correlation Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất đ nh trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác đ nh cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE trong kĩ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác đ nh cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác đ nh thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR b chồng lấp nhiều, khó xác đ nh chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn v đường thì việc xác đ nh chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác đ nh bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
CHƢƠNG 3.
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các hợp chất
Quả loài Na biển Annona glabra được thái nhỏ, phơi khô, nghiền m n thu được 4 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 5 lít) bằng thiết b chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 giờ). Các d ch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 300 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane và chloroform. Các d ch chiết n-hexane, chloroform được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn n-hexane (AGH, 31,0 g), chloroform (AGC, 150,0 g) và lớp nước (AGW, 119,0 g).
Phân đoạn chloroform AGC (150,0 g) được hòa tan bằng chloroform, tẩm với silica gel (1/2,5, m/m), cất loại dung môi đến khô, nghiền m n đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane/ethyl acetate (100/1 → 1/100, v/v) thu được 5 phân đoạn AGC1, AGC2, AGC3, AGC4 và AGC5.
Phân đoạn AGC2 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (4/1, v/v) kết hợp với với sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải bằng acetone/nước (3,5/1,0, v/v) thu được hợp chất 1 (321,0 mg) và 4 (51,0 mg).
Phân đoạn AGC4(19 g) tiếp tục được phân tách thành 4 phân đoạn AGC4A, AGC4B và AGC4Cbằng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (5/1, v/v). Hợp chất 2 (7,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn AGC4A (5 g) bằng cột sắc ký silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (5/1, v/v). Hợp chất 3 (10,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn AGC4C (6 g) bằng cột sắc ký silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol tỉ lệ (15/1, v/v).
Sơ đồ phân lập nhƣ sau:
Ch
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất.
AGC (150 g) AGH (31 g) AGW (119 g) 9 Hợp chất 1 (321 mg) AGC4A (5 g) AGC4B (8 g) AGC4C ( 6 g)
Chloroform, tẩm silica gel Sắc ký silica gel pha thường
1/1 100% Ethyl acetate n-Hexane 100% 30/1 3030/1 5/1
Sắc ký silica gel pha thường n-hexane/ ethyl acetate, 4/1
Sắc ký cột silica gel pha đảo Acetone/ nước, 3,5/1
Sắc ký silica gel pha thường Diclorometan/ acetone, 5/1
Sắc ký silica gel pha thường Diclorometan/ metanol, 15/1 Hợp chất 4 (51 mg) AGC1 AGC2 ( 372 mg) AGC3 AGC4 (19 g) AGC5 Bột quả Na biển (4 kg) Cặn chiết MeOH (300 g) Hợp chất 2 (7 mg) Hợp chất 3 (10 mg) Chiết MeOH Bổ sung nước
Chiết n-hexane và chloroform
Sắc ký cột silica gel pha đảo Acetone/ nước, 5/1
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập 7, 8.
3.2.1. Hợp chất 1: 16,17-dihydroxy-ent-kaurane
Tinh thể hình kim, không màu.
Công thức phân tử C20H34O2 (M = 306).
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) xem bảng 4.1.
3.2.2. Hợp chất 2: 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al
Tinh thể hình kim, không màu.
Công thức phân tử C20H32O3, (M = 320).
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem bảng 4.2.
3.2.3. Hợp chất 3: 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid
Tinh thể hình kim, màu trắng.
Công thức phân tử C20H32O4 (M = 336).
1
H-NMR (500 MHz, C5D5N) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N) xem bảng 4.3.
3.2.4. Hợp chất 4: 16,17-dihydroxy-ent-kaurane
Tinh thể hình kim, không màu.
Công thức phân tử C20H34O2, (M = 306).
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) xem bảng 4.4.
Hình 3.1: Cấu trúc hoá học của 1– 4.
CHƢƠNG 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc
4.1.1. Hợp chất 1: 16,17-dihydroxy-ent-kaurane 7.
.
Hình 4.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1
Hợp chất 1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu. Phổ 1
H-NMR của 1 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl tại H 0,79 (3H, s), 0,84 (3H, s), 1,02 (3H, s) và tín hiệu của proton oxymethylene tại H 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz) và 3,46 (1H, d, J = 11,0 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 20 cacbon, bao gồm 3 nhóm methyl bậc 4 [δC 17,57 (C-20), δC 21,60 (C-19) và δC 33,60 (C-18)], 1 nhóm oxymethylene tại C 69,90 (C-17), 1 cacbon bậc bốn tại C 79,82. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một diterpenoid khung kaurane có 2 nhóm hydroxyl. Tiến hành tra cứu tài liệu tham khảo cho biết số liệu phổ của hợp chất này phù hợp với số liệu phổ của 16,17-dihydroxy-
ent-kaurane [7].
Các proton liên kết trực tiếp với cacbon thông qua các tương tác trên phổ HSQC. Các tương tác HMBC giữa H-18 (H 0,84) và H-19 (H 0,79) với các tín hiệu cacbon δC 42,10 (C-3), 33,27 (C-4), 56,21 (C-5) khẳng đ nh v trí của 2 nhóm methyl này tại C-4; các tương tác HMBC giữa H-20 (H 1,02) với các tín hiệu cacbon δC 40,45 (C-1), 56,21 (C-5), 57,06 (C-9), 39,43 (C-10) gợi ý v trí của nhóm methyl này tại C-10. V trí 2 nhóm hydroxyl tại C-16 và C-17 được
khẳng đ nh lại nhờ tương tác HMBC giữa proton tại H 3,38 và 3,46 (H-17) với các tín hiệu cacbon tại C 79,82 (C-16), 40,89 (C-13) và 52,84 (C-15). Cấu hình
của nhóm hydroxyl tại C-16 được xác đ nh bằng cách so sánh giá tr độ chuyển d ch hóa học cacbon của hợp chất 1 tại C-16, C-17 với các số liệu tương ứng của hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kaurane. Các v trí của cacbon trong phân tử được xác đ nh chi tiết bởi kết hợp phổ 1D và 2D-NMR. Độ chuyển d ch hóa học
13
C-NMR của 1 có sự sai khác với 16,17-dihydroxy-ent-kaurane được công bố trong tài liệu tham khảo [7]. Ở các v trí C-7, C-13, C-14 và C-15. Cụ thể C của C-7 và C-14 trong tài liệu tham khảo cần đổi chỗ dựa trên tương tác HSQC H-14 (H 0,99 và 1,99)/C-14 (C 38,32), H-14 lại có tương tác HMBC với C-16 (C
79,82). Độ chuyển d ch hóa học tại C-13, C-15 được xác đ nh bởi tương tác HMBC giữa H-17 (H 3,38 và 3,46) với C-13 (C 40,89) và C-15 (C 52,84). Từ tất cả các phân tích nêu trên, hợp chất 1 được xác đ nh là 16,17-dihydroxy-ent- kaurane [7].
Hình 4.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất 1
Hình 4.5: Phổ HSQC của hợp chất 1
Bảng 4.1: Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1 và các hợp chất tham khảo C 1 †C C a DEPT a(J = Hz) 1 41,4 40,45 CH2 0,76* 1,82 (d, 12,5) 2 18,7 18,82 CH2 1,63 (m) 1,41* 3 42,0 42,10 CH2 1,12* 1,46 (m) 4 33,2 33,27 C - 5 56,1 56,21 CH 0,77* 6 20,0 20,05 CH2 1,25* 1,51* 7 38,2 41,93 CH2 1,37* 8 43,5 43,58 C - 9 56,9 57,06 CH 1,12* 10 39,3 39,43 C - 11 18,6 18,64 CH2 1,87 (m) 1,63* 12 26,7 26,76 CH2 1,55* 1,75 (m) 13 52,6 40,89 CH 2,07 (m) 14 40,4 38,32 CH2 0,99 (brd, 12,0) 1,99 (brd, 12,0) 15 56,1 52,84 CH2 1,41* 16 79,7 79,82 C - 17 69,7 69,90 CH2 3,38 (d, 11,0) 3,46 (d, 11,0) 18 33,6 33,60 CH3 0,84 (s) 19 21,5 21,60 CH3 0,79 (s) 20 17,6 17,57 CH3 1,02 (s)
Kết luận
Hợp chất 1: 16,17-dihydroxy-ent-kaurane
Công thức phân tử: C20H34O2 (M = 306). Công thức cấu tạo:
Hình 4.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2
Hợp chất 2 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu. Trên phổ khối lượng (LC-MS) xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 343,2 [M+Na]+. Cùng với các phổ NMR cho phép xác đ nh công thức phân tử của 2 là C20H32O3, (M = 320). Phổ 1H-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 4 tại H 0,93 (3H, s), 1,00 (3H, s) và tín hiệu của 1 proton aldehyde tại H 9,75 (1H, d, J = 1,5 Hz). Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của 2 cũng tương tự như 1 cho thấy đây cũng là một hợp chất dạng diterpenoid khung kaurane. Thông qua các tương tác trực tiếp H-C trên phổ HSQC, độ chuyển d ch hóa học của các proton được gán tương ứng với cacbon. Các tương tác HMBC giữa H-18 (H 1,00)/H- 19 H 9,75 với C-3 (C 35,28), C-4 (C 49,84), C-5 (C 57,90) cho phép xác đ nh nhóm methyl và aldehyde tại C-4; tương tác giữa H-20 (H 0,93) với các cacbon
C 41,02 (C-1), C 57,90 (C-5), C 57,19 (C-9) và 40,65 (C-10) gợi ý sự có mặt nhóm methyl tại C-10. Như vậy 2 có cấu trúc tương tự 1 nhưng nhóm methyl C- 19 được thay thế bằng nhóm aldehyde. Giá tr độ chuyển d ch hóa học cacbon của 2 hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ của hợp chất 16,17-dihydroxy-ent- kauran-19-al. Từ các dữ kiện này, cấu trúc hóa học của 2 được xác đ nh là 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al.
Hình 4.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 2
Hình 4.10: Phổ DEPT của hợp chất 2
Hình 4.12: Phổ HMBC của hợp chất 2
C 2 ‡C C b DEPT b (J=Hz) 1 40,9 41,02 CH2 1,90 (m) 0,88 (m) 2 19,4 19,47 CH2 2,07* 1,44 (m) 3 35,4 35,28 CH2 2,12 (m) 1,06 (m) 4 49,0 49,84 C - 5 56,9 57,90 CH 1,23 (dd, 2,5, 12,5) 6 21,2 20,71# CH2 1,59 (m) 1,63 (m) 7 43,2 43,08 CH2 1,52 (m) 8 45,5 44,69 C - 9 57,9 57,19 CH 1,16 (br s) 10 40,7 40,65 C - 11 21,2 19,82# CH2 1,89 (m) 1,72 (m) 12 27,1 27,77 CH2 1,84 (m) 1,49 (m) 13 45,5 42,20 CH 2,08* 14 38,4 39,41 CH2 2,00 (dd, 2,0, 12,0) 1,13 (m) 15 54,0 53,09 CH2 1,45 (s) 16 83,0 80,74 C - 17 66,9 70,61 CH2 3,32 (d, 11,5) 3,43 (d, 11,5) 18 24,5 24,57 CH3 1,00 (s) 19 207,0 207,87 CHO 9,75 (d, 1,5) 20 17,0 16,85 CH3 0,93 (s)
b đo trong CD3OD, ‡C số liệu phổ của 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al trong CD3OD.
Kết luận
Hợp chất 2: 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al
Công thức phân tử: C20H32O3, (M = 320).
Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3
Hợp chất 3 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Phổ 1
H- NMR của 3 xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl tại H 1,21 (3H, s) và 1,34 (3H, s). Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của 3 xuất hiện 1 tín hiệu cacbon bậc bốn ở vùng trường thấp (C 180,18) đặc trưng cho sự có mặt của nhóm carboxylic acid. Số liệu phổ NMR của 3 giống với của hợp chất 2 ngoại trừ sự khác biệt về độ chuyển d ch hóa học tại C 180,18. Dữ liệu phổ 13C-NMR của 3 hoàn toàn tương tự với dữ liệu phổ của hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid thấy hoàn toàn phù hợp tại các v trí tương ứng [8]. Do đó, cấu trúc hóa học của
3 được xác đ nh là 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid.
Hình 4.16: Phổ 13C-NMR của hợp chất 3
C 3 $C Cc DEPT c (J=Hz) 1 41,1 41,16 CH2 2 19,8 19,85 CH2 3 38,7 38,73 CH2 4 43,9 43,91 C 5 57,0 57,07 CH 6 22,9 22,48 CH2 7 42,7 42,50 CH2 8 44,9 43,96 C 9 56,3 56,72 CH 10 40,0 40,07 C 11 18,9 19,43# CH2 12 26,8 27,57 CH2 13 45,8 41,67 CH 14 37,8 38,58 CH2 15 53,9 53,38 CH2 16 81,6 79,81 C 17 66,4 70,49 CH2 3,84 (d, 10,5) 3,77 (d, 10,5) 18 29,3 29,37 CH3 1,34 (s) 19 180,1 180,18 COOH - 20 15,4 15,96 CH3 1,21 (s)
c đo trong C5D5N, $C của 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid trong CDCl3.
Kết luận
Hợp chất 3:16,17- dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid
Công thức phân tử: C20H32O4 (M = 336).
Hình 4.18: Cấu trúc hóa học của hợp chất 4
Hợp chất 4 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu. Phổ 1
H-, 13C- NMR và DEPT của 4 tương tự như của 1 với xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl bậc 4 [δC 17,72 (C-20)/ δH 1,01 (H-20); δC 21,55 (C-19)/ δH 0,80 (H-19) và δC 33,56 (C-18)/ δH 0,84 (H-18)]; 1 nhóm oxymethylene tại C 66,38 (C-17)/ δH 3,65 (H-17a), 3,77 (H-17b) và 1 tín hiệu cacbon bậc bốn tại 81,89. Dễ dàng nhận thấy sự khác nhau về độ chuyển d ch hóa học của C-13 (C 45,51), C-16 (C
81,89) và C-17 (C 66,38) ở 4 so với ở 1: C-13 (C 40,89), C-16 (C 79,82) và C- 17 (C 69,90) đã gợi ý sự khác nhau về cấu hình tại C-16. Tiến hành tra cứu tài liệu tham khảo, nhận thấy số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn phù hợp tại các v trí tương ứng của hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kaurane [7]. Vì vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 4 được xác đ nh là một đồng phân của 1 và là 16,17- dihydroxy-ent-kaurane [7].
Hình 4.19: Phổ 1H-NMR của hợp chất 4
C *C C a DEPT a (J = Hz) 1 42,0 42,02 CH2 2 18,2 18,28 CH2 3 42,0 42,06 CH2 4 33,4 33,26 C - 5 56,1 56,17 CH 0,77 (dd, 2,0, 12,0) 6 20,5 20,45 CH2 7 37,2 37,31 CH2