5. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
2.2.2 Phân tích chỉ tiêu
2.2.2.1 Hàm lượng axit amin proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp của Bates và cs (1973) và cải tiến của Đinh Thị Phòng 2001 [21].
Cân 0,5 g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhydrin (thành phần của dung dịch này là 1,25 g ninhydrin và 30ml axit axetic) đậy kín, đảo đều.
Ủ trong nước nóng 100oC trong thời gian 1 giờ sau đó ủ trong nước đá 5
phút. Bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng trên đem đo mật độ quang học ( D - ptical density) bước sóng λ = 520 nm trên máy UV 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản sản xuất (công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn proline).
Y = 0,0179 . X + 0,095 (R2 = 0,99)
Trong đó: Y. Nồng độ proline (g / ml)
X. Giá trị D đo bước sóng λ = 520 nm
Sau đó hàm lượng proline được đổi ra g / gtheo công thức:
.
Y V A
P
Trong đó: : hàm lượng proline (g / g)
P: khối lượng mẫu (g)
V: thể tích dịch proline chiết được (ml)
Tất cả các axit amin đều phản ứng màu với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng axit amin như proline tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức tạp. Hợp chất màu vàng có cực đại hấp th bước sóng λ= 520 nm.
2.2.2.2 Hàm lượng diệp lục tổng số
Xác định chỉ số hàm lượng diệp l c tổng số bằng cách đo trên máy Chlorophyll meter SPAD - 502, do Nhật Bản sản xuất [15].
Đặc điểm: đây là loại máy chuyên d ng cầm tay rất thuận lợi cho nghiên cứu đồng ruộng, hoạt động bằng pin, đo hàm lượng diệp l c tổng số của lá, đơn vị mặc định của máy là SP D. Máy gồm một bộ xử lí, buồng đo và màn hình hiển thị kết quả.
Nguyên tắc hoạt động của máy: diệp l c có khả năng hấp th ánh sáng 2 vùng xanh (blue) và đỏ (red) nhưng không hấp th ánh sáng lá cây (green) hoặc ánh sáng đỏ xanh (hồng ngoại) bằng việc xác định nguồn năng lượng hấp th được vùng đỏ có thể ước tính được lượng diệp l c có trong mô lá.
Cách đo: kẹp lá vào buồng đo đồng thời ấn nhẹ, trong vòng 30 giây đến 1 phút, đến khi máy phát ra tín hiệu âm thanh, khi đó đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.2.2.3 Huỳnh quang diệp lục
Huỳnh quang diệp l c được đo trên máy chlorophyll fluorometer OS - 30 do hãng ADC- nh cung cấp. Thời gian ủ tối là 10 phút để các tâm phản ứng trạng thái “m ” hoàn toàn hay toàn bộ chất nhận điện tử đầu tiên trong mạch vận chuyển
điện tử quang hợp Quinon (QA) trạng thái oxi hóa.
- Máy đo xác định các chỉ tiêu:
+ F0: huỳnh quang ổn định F0 phản ánh sự mất đi năng lượng kích thích bằng bức
xạ trong khoảng thời gian vận chuyển chúng về tâm phản ứng PSII trạng thái “m ”.
+ Fm: cường độ huỳnh quang cực đại, Fm đo được khi các tâm phản ứng PSII trạng
thái “đóng”.
+ Fvm: hiệu suất huỳnh quang biến đổi.
Fvm phản ánh hiệu quả sử d ng năng lượng ánh sáng trong phản ứng quang hóa
được xác định như sau:
v m 0 vm m m F F - F F = = F F
Lá chọn để đo các chỉ tiêu diệp l c, huỳnh quang được thực hiện trên cùng một tầng lá (tầng thứ ba tính từ ngọn xuống). Đo mẫu thí nghiệm đã gây lạnh và mẫu đối chứng (bình thường).
2.2.2.4 Cường độ quang hợp
Xác định cường độ quang hợp hấp th C 2 trong quang hợp nhờ hệ thống PP
SYSTEM TPS - 2 [15].
Nguyên tắc thí nghiệm:
Sử d ng thiết bị PP SYST M TPS - 2 phân tích chỉ tiêu quang hợp (CO2)
của cây trồng dựa trên phương pháp phát hiện bằng detector hồng ngoại.
Máy sử d ng bộ vi xử lý điện tử điều khiển và thiết lập các thông số đo, hiện thị kết quả đo trên màn hình LCD.
Thiết bị, vật liệu: máy đo cường độ quang hợp PP SYST M TPS - 2, mẫu lá (chọn các lá cùng tầng tốt nhất là tầng thứ 3 từ trên xuống).
Cách tiến hành:
Bước 1: Kết nối đầu dò thu tín hiệu vào chân PLC, kết nối đầu khí vào của đầu dò (ký hiệu là trên đầu dò) vào cổng PCL. trên máy đo. Kết nối đầu khí ra của đầu dò (ký hiệu là R trên đầu dò) vào cổng PCL R trên máy đo.
Bước 2: Ấn vào nút Power để m máy, chờ máy kh i động (khi máy hiển thị nhiệt
độ sư i ấm 55o
C thì kh i động xong)
Bước 3: Trong khi chờ máy kh i động thiết lập thông số của phép đo như chế độ lưu tự động hay lưu bằng tay, chế độ ánh sáng tự nhiên hay đèn led, mức độ chiếu sáng…
Bước 4: Sau khi máy kh i động xong ta chọn mẫu lá để đo, chọn các mẫu lá cùng tầng tốt nhất là lá thứ 3 từ trên xuống vì lá đó có khả năng quang hợp tốt nhất.
Bước 5: Sau khi chọn được lá cần đo phải lau sạch lá (chú ý không được làm tổn thương lá). Kẹp buồng lá vào lá cần đo theo đúng kỹ thuật.
Bước 6: Chờ thông số C 2 hiển thị tương đối ổn định rồi ấn nút 4/X để xem dữ liệu
tính toán của phép đo, ghi lại kết quả đo.
Tiếp t c ta kẹp buồng lá vào các lá khác để đo mẫu tiếp theo.