2.3.2.1.Chuẩn bị dung dịch nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và chứng dương
Nước tiểu nhân tạo: Dung dịch nước tiểu nhân tạo được pha theo công thức của Kavanagh và cộng sự (1999) [35] và có điều chỉnh để phù hợp với mô hình trên bản nhọn 96 giếng:
NaCl: 368,0 MgCl2: 7,5 KCl: 188,825 Na3C6H5O7: 5,0 Na2HPO4: 57,5 CaCl2: 15,0
(NH4)2SO4: 50,375 dung môi: nước cất 2 lần NH4Cl: 8,05 (đơn vị: mmol/l)
Làm ấm dung môi đến 37oC, hòa tan lần lượt các thành phần trên và điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 1N đến pH 6,0 ± 0,1. Sau đó để ổn định ở 37o
C.
Dung dịch acid oxalic: được chuẩn bị với nồng độ 0,04N và được để ổn định ở 37o
C.
Dung dịch chứng dương natri citrat:được chuẩn bị với nồng độ 15mM và được để ổn định ở 37o
C.
2.3.2.2.Chuẩn bị dịch chiết dược liệu: từng loại dịch thử dược liệu được chuẩn bị theo mô tả ở mục 3.1.
2.3.2.3.Triển khai thí nghiệm
Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic như mô tả phần 2.3.2.1; dịch chiết dược liệu như mô tả ở mục 3.1.; với chứng dương là natri citrat (15mM) chuẩn bị như mô tả tại 2.3.2.1. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 3 lô (mỗi lô tiến hành thử trên 8 giếng), thành phần cho vào mỗi giếng tương ứng mỗi lô như sau:
+ Lô trắng sỏi: 160µl nước tiểu nhân tạo + 20µl dung môi* + 20µl dung dịch acid oxalic.
+ Lô trắng dịch chiết: 160µl nước tiểu nhân tạo + 20µl nước + 20µl dịch
chiết dược liệu.
+ Lô thử: 160µl nước tiểu nhân tạo + 20µl dịch chiết dược liệu + 20µl dung dịch acid oxalic.
+ Lô chứng dương: 160µl nước tiểu nhân tạo + 20µl dung dịch natricitrat + 20µl dung dịch acid oxalic.
Chú ý: Dịch chiết dược liệu và natri citrat cùng môi trường được ủ ở 37o C ổn định trong 5 phút trước khi cho dung dịch acid oxalic để quá trình tạo tinh thể xảy ra.
Dung môi* là dung môi dùng để pha loãng dịch chiết dược liệu cũng như chứng dương.
Xác định mật độ quang ở bước sóng 620nm (OD620 nm), tại thời điểm 5 phút sau khi thêm acid oxalic vào hỗn hợp phản ứng để tạo sỏi. Thời gian này được xác định là thời gian thể hiện tác dụng rõ nhất của chất thử [13]
Chụp ảnh tinh thể: sau khi kết thúc thí nghiệm, tinh thể trong các giếng được quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40. Mỗi lô trong thí nghiệm được quan sát ở 8 vi trường trên 8 giếng, sau đó vi trường đại diện cho mỗi lô được chụp lại bằng máy ảnh Canon kết nối trực tiếp với kính hiển vi.
2.3.3. Đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat của dược liệu thử
Tác dụng của dịch chiết dược liệu được đánh giá thông qua các thông số sau:
Giá trị OD620nm
Tính % ức chế được theo công thức:
% ức chế = I (%) = × 100 (1)
a: ODTB mẫu trắng sỏi
b: ODTB mẫu trắng dung dịch thử
c: ODTB mẫu tạo sỏi khi có mặt dung dịch thử
(ODTB là giá trị trung bình của OD620nm trên 8 giếng thử của mỗi lô trong 1 thí nghiệm)
+ Nếu I > 0: chất thử có tác dụng ức chế quá trình hình thành sỏi do làm giảm số lượng hoặc kích thước tinh thể.
+ Nếu I ≤ 0: chất thử không có tác dụng ức chế số lượng tinh thể tạo thành. Trong trường hợp này, ảnh hưởng của chất thử lên quá trình tạo sỏi được đánh giá thông qua độ tăng mật độ quang (ΔOD) tính theo công thức:
ΔOD = c - b – a (2)
Khi đó, để khẳng định dược liệu có tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu hay không cần thêm các đánh giá trên hình ảnh chụp tinh thể.
Để đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết trên tinh thể sỏi tạo thành cũng như sự phụ thuộc giữa tác dụng và nồng độ của dịch chiết cần tiến hành so sánh hình ảnh chụp được giữa lô trắng sỏi với các lô thử; giữa các lô thử với nhau về:
+ Số lượng tinh thể: lô thử có số lượng ít hơn thì dược liệu có khả năng ức chế hình thành sỏi tiết niệu thông qua ức chế số lượng tinh thể tạo thành.
+ Kích thước tinh thể: lô thử có kích thước nhỏ hơn tức dược liệu có khả năng ức chế hình thành sỏi tiết niệu thông qua ức chế sự lớn lên của tinh thể.
+ Hình dạng tinh thể: lô thử có tỷ lệ dạng COD/COM lớn hơn thì dược liệu có khả năng ức chế hình thành sỏi tiết niệu thông qua khả năng ức chế tạo thành tinh thể dạng COM (dạng tinh thể có khả năng tạo sỏi cao) và tăng tạo thành tinh thể dạng COD (dạng tinh thể ít có khả năng tạo sỏi).