2.3.4.1. Đánh giá cấu trúc tiểu phân bằng KHV điện tử truyền qua (TEM)
Nguyên tắc: Một chùm electron hội tụ có năng lƣợng cao đƣợc truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tƣơng tác giữa các điện tử và mẫu có hai kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tƣơng tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lƣợng; trong tƣơng tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lƣợng và tạo ra nhiều tín hiệu nhƣ điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền đƣợc qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lƣợng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo ra ảnh hai chiều của mẫu phân tích [24].
- Nguyên tắc: Kích thƣớc hạt đƣợc xác định bằng phƣơng pháp tán xạ lade. Nguyên lý của phƣơng pháp là khi chiếu chùm tia lade vào các hạt có kích thƣớc khác nhau sẽ thu đƣợc mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau do chuyển động Brown. Phân tích sự dao động cƣờng độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào hạt ta có thể đánh giá đƣợc chuyển động Brown và xác định đƣợc kích thƣớc hạt nhờ phƣơng trình Stokes – Einstein [18].
- Phƣơng pháp:
+ Pha loãng mẫu 100 lần bằng nƣớc cất đã lọc qua màng có kích thƣớc lỗ xốp là 0,2 µm.
+ Sử dụng cuvet thủy tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,34 và độ hấp thụ là 0,001.
2.3.4.3. Đánh giá thế Zeta
- Nguyên tắc: Khi đặt một trƣờng điện từ lên môi trƣờng phân tán, các hạt mang điện di chuyển đến điện cực trái dấu với tốc độ tỉ lệ với giá trị thế Zeta. Tốc độ này đƣợc xác định nhờ phân tích sự dao động của tia lade tán xạ do các tiểu phân di chuyển. Thế Zeta đƣợc xác định dựa vào độ nhớt của môi trƣờng phân tán và định luật Smoluchowski – Huckel [18].
- Phƣơng pháp: Tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xác định kích thƣớc tiểu phân, sử dụng cuvet nhựa.
2.3.5. Định lượng
- Tiến hành bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện nhƣ sau [31]:
+ Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (5 μm), 150 x 4,6 mm. + Detector quang phổ tử ngoại có bƣớc sóng 261 nm. + Thể tích tiêm: 20 l.
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
+ Dung dịch thử: hút chính xác một lƣợng hỗn dịch tƣơng ứng khoảng 30 mg fluconazol cho vào bình định mức 50 ml, thêm 10 ml ethanol, siêu âm cho dƣợc chất tan hết, thêm nƣớc cất đến định mức, trộn đều và lọc.
+ Dung dịch chuẩn: hòa tan một lƣợng fluconazol chuẩn trong nƣớc để thu đƣợc dung dịch có nồng độ 600 µg/ml.
- Tính hàm lƣợng fluconazol có trong mẫu và hiệu suất quy trình dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử.
Công thức tính hàm lƣợng: X = 50 nano chuan chuan nano V C S S Trong đó:
X : Nồng độ fluconazol có trong mẫu.
nano
S : Diện tích pic dung dịch thử.
chuan
S : Diện tích pic dung dịch chuẩn đã biết trƣớc nồng độ.
chuan
C : Nồng độ dung dịch fluconazol chuẩn.
nano
V : Thể tích hỗn dịch đã hút.
Công thức tính hiệu suất: H = 25100
fluconazol m
X
Trong đó:
H : Phần trăm khối lƣợng fluconazol có trong mẫu so với fluconazol ban đầu.
X : Nồng độ fluconazol có trong mẫu.
fluconazol
m : Khối lƣợng bột fluconazol dùng để bào chế mẫu.
2.3.6. Đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ nano
- Khả năng giải phóng dƣợc chất từ hệ nano đƣợc đánh giá qua hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể nhƣ sau: + Màng thẩm tích làm từ cellulose tái sinh, cho phân tử có khối lƣợng từ 12000 đến 14000 Da đi qua, diện tích bề mặt màng giải phóng là 0,785cm2
. + Môi trƣờng khuếch tán: Dung dịch đệm PBS pH 7,4 gồm:
Natri clorid 8,00 g Kali clorid 0,20 g Dinatri hydrophosphat 1,44 g Kali dihydrophosphat 0,24 g Nƣớc cất vđ 1000 ml + Thể tích môi trƣờng khuếch tán: V = 7ml. + Nhiệt độ môi trƣờng khuếch tán: 37 ± 0,50C . + Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.
+ Lấy mẫu: Thử trong 7 giờ, sau mỗi giờ lấy v = 1ml dung dịch, bổ sung 1ml môi trƣờng khuếch tán mới. Xác định lƣợng fluconazol giải phóng bằng phƣơng pháp HPLC theo mục 2.3.5.
Hình 2.2: Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research
- Đánh giá mức độ giải phóng fluconazol của hỗn dịch nano:
Mức độ giải phóng dƣợc chất từ các mẫu hỗn dịch đƣợc đánh giá dựa trên phần trăm dƣợc chất đã giải phóng ra từ thời điểm t.
+ Nồng độ fluconazol trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm t đƣợc tính theo công thức: Ct = ch
ch
t C
S S
Trong đó:
Ct : Nồng độ fluconazol trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml) Cch : Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml)
St : Diện tích pic của mẫu thử Sch : Diện tích pic của mẫu chuẩn
+ Lƣợng fluconazol giải phóng từ các mẫu hỗn dịch tại thời điểm t đƣợc tính theo công thức: 1 n t t i i Q C V v C Trong đó:
Qt : Tổng lƣợng fluconazol đã giải phóng tại thời điểm t (µg) V : Thể tích môi trƣờng khuếch tán (ml)
v : Thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml)
Ct : Nồng độ fluconazol trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml) Ci : Nồng độ fluconazol trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm ngay trƣớc đó (µg/ml)
+ Tỷ lệ phần trăm fluconazol đã giải phóng từ các mẫu nghiên cứu tại thời điểm t xác định theo công thức: t 100
t Q X x M Trong đó:
Xt : Phần trăm fluconazol đã giải phóng tại thời điểm t (%) Qt : Lƣợng fluconazol đã giải phóng tại thời điểm t (mg) M : Khối lƣợng fluconazol có trong mẫu thử (mg)
Chƣơng III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của tá dƣợc và thông số kỹ thuật đến hệ nano
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số thông số kỹ thuật
Các thông số kỹ thuật ảnh hƣởng đến sự hình thành và ổn định của tiểu phân nano. Hệ nano fluconazol đƣợc bào chế với công thức ghi trong bảng 3.1 theo phƣơng pháp trình bày ở mục 2.3.1. Nhiệt độ và thiết bị gây phân tán ở giai đoạn nhũ hóa trong quy trình bào chế đƣợc thay đổi. Đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố này dựa vào kích thƣớc tiểu phân của sản phẩm thu đƣợc.
Bảng 3.1: Công thức bào chế nano fluconazol
Thành phần Số lƣợng
Pha nội Fluconazol
Eudragit RS 100 Diclomethan Ethanol 100 mg 100 mg 5 ml 2,5 ml
Pha ngoại PVA
Nƣớc cất
2 g 100 ml
3.1.1.1. Nhiệt độ trong quá trình nhũ hóa
Bào chế mẫu trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau:
- Từ 00C đến 50C: sản phẩm có kích thƣớc tiểu phân dƣới 200 nm và đồng đều. - Từ 50C đến 100C: sản phẩm có kích thƣớc tiểu phân trên 200 nm.
- Trên 100C: sản phẩm có kích thƣớc tiểu phân lớn hơn 500 nm.
Nhƣ vậy, nhiệt độ quá trình nhũ hóa càng thấp, tiểu phân có kích thƣớc càng nhỏ. Do đó nhiệt độ nhũ hóa ở các thử nghiệm tiếp theo đều đƣợc duy trì dƣới 50C.
3.1.1.2. Thiết bị gây phân tán
- Máy siêu âm (tần số 30000 Hz, công suất 100 W): lực siêu âm giúp tạo ra tiểu phân nano có kích thƣớc nhỏ hơn 150 nm nhƣng kém đồng nhất hơn so với máy đồng nhất hóa (PDI trên 0,25). Bên cạnh đó, trong quá trình tác động lực có hiện
tƣợng tủa polyme, do đó ảnh hƣởng đến cấu trúc và hiệu suất quy trình bào chế. Vì vậy máy siêu âm không đƣợc chọn.
- Máy khuấy cầm tay có khả năng chia cắt pha tốt nhƣng cũng làm tăng nhanh nhiệt độ nhũ tƣơng, thao tác không thuận tiện.
- Máy đồng nhất hóa có ƣu điểm là sử dụng dễ dàng, tạo tiểu phân có kích thƣớc dƣới 200 nm và PDI khoảng 0,2. Do đó, máy đồng nhất hóa đƣợc chọn cho các thử nghiệm sau.
3.1.1.3. Tốc độ của máy đồng nhất
Tốc độ khuấy của máy đồng nhất đƣợc khảo sát ở 3 mức:
- Dƣới 8000 vòng/phút: Tiểu phân có kích thƣớc lớn do bề mặt phân cách pha đƣợc chia cắt kém.
- Từ 8000 đến 11000 vòng/phút: Kích thƣớc tiểu phân giảm dần. Ở tốc độ 11000 vòng/phút, kích thƣớc trung bình của tiểu phân là 162,1 nm, PDI là 0,202.
- Trên 11000 vòng/phút: Tiểu phân tạo thành không có sự thay đổi đáng kể về kích thƣớc nhƣng PDI tăng lên.
Vì vậy tốc độ khuấy của máy đồng nhất đƣợc chọn là 11000 vòng/phút.
3.1.1.4. Thời gian tác động lực phân tán
Sử dụng máy đồng nhất hóa để bào chế mẫu trong thời gian lần lƣợt là 3 phút, 4 phút và 5 phút. Kích thƣớc tiểu phân của các mẫu thay đổi không đáng kể. Vì tác động lực kéo dài có nguy cơ làm tăng nhiệt độ mẫu và thất thoát fluconazol trong quá trình bào chế nên các mẫu tiếp theo đều đƣợc nhũ hóa trong vòng 3 phút.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược
3.1.2.1. Hệ dung môi hòa tan dược chất
Với yêu cầu hòa tan tốt fluconazol, không đồng tan với nƣớc và bay hơi nhanh, các dung môi diclomethan, ethyl acetat (dung môi 1) phối hợp với ethanol và methanol (dung môi 2) đƣợc sử dụng để bào chế hệ nano.
Các mẫu đƣợc bào chế với các thành phần nhƣ trong bảng 3.2. Kích thƣớc tiểu phân ngay sau khi bào chế đƣợc tổng kết ở bảng 3.3.
Bảng 3.2: Công thức bào chế nano fluconazol sử dụng các dung môi khác nhau
Thành phần Số lƣợng
Pha nội Fluconazol
Eudragit RS 100 Dung môi 1 Dung môi 2 100 mg 100 mg 5 ml 2,5 ml
Pha ngoại PVA
Nƣớc
2 g 100 ml
Bảng 3.3: Kích thƣớc tiểu phân nano fluconazol bào chế với các hệ dung môi khác nhau
Mẫu Dung môi 1 Dung môi 2 Kích thƣớc (nm) PDI
1 Diclomethan Ethanol 162,1 0,202
2 Diclomethan Methanol 175,0 0,188
3 Ethyl acetat Ethanol >500 >0,5
4 Ethyl acetat Methanol >500 >0,5
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: những mẫu dùng ethyl acetat có kích thƣớc tiểu phân lớn còn các mẫu sử dụng diclomethan cho tiểu phân có kích thƣớc nhỏ và đồng đều. Vì sử dụng ethanol rẻ tiền và ít độc hơn so với methanol nên hệ dung môi diclomethan, ethanol đƣợc sử dụng cho các mẫu bào chế tiếp theo.
3.1.2.2. Tỉ lệ các thành phần trong hệ dung môi
Để khảo sát tỉ lệ hỗn hợp dung môi, các mẫu đƣợc bào chế với 7,5 ml hỗn hợp diclomethan và ethanol có tỉ lệ nhƣ trong bảng 3.4. Các thành phần còn lại ghi ở bảng 3.2.
Kết quả khảo sát cho thấy khi tỉ lệ giữa ethanol và diclomethan càng tăng, tiểu phân có kích thƣớc càng lớn. Do đó, diclomethan ảnh hƣởng nhiều đến kích thƣớc tiểu phân fluconazol. Mẫu 5 và 6 có kích thƣớc gần nhƣ nhau nhƣng mẫu 5 với 100% diclomethan đƣợc lựa chọn vì ethanol sẽ làm tăng độ tan của fluconazol trong pha ngoại, làm giảm hiệu suất quy trình.
Bảng 3.4: Kích thƣớc tiểu phân nano fluconazol bào chế với tỉ lệ dung môi khác nhau
Mẫu Ethanol : diclomethan Kích thƣớc (nm) PDI
5 0:7,5 161,0 0,210
6 1:2 162,1 0,202
7 1:1 218,3 0,242
3.1.2.3. Khối lượng Eudragit RS 100
Lƣợng Eudragit RS 100 ảnh hƣởng nhiều tới kích thƣớc, phân bố kích thƣớc và cấu trúc tiểu phân fluconazol. Để đánh giá sự ảnh hƣởng này, các mẫu đƣợc bào chế với lƣợng Eudragit thay đổi từ 100 mg đến 500 mg, các thành phần còn lại nằm trong bảng 3.5. Kết quả đo kích thƣớc tiểu phân đƣợc ghi ở bảng 3.6.
Bảng 3.5: Công thức bào chế nano fluconazol với lƣợng Eudragit RS 100 thay đổi
Thành phần Số lƣợng
Pha nội Fluconazol
Eudragit RS 100 Diclomethan
100 mg Thay đổi
7,5 ml
Pha ngoại PVA
Nƣớc
2 g 100 ml
Bảng 3.6: Kích thƣớc tiểu phân fluconazol bào chế với lƣợng Eudragit RS 100 thay đổi
Mẫu Khối lƣợng Eudragit (mg) Kích thƣớc (nm) PDI
8 100 162,1 0,202
9 200 229,0 0,114
10 300 289,3 0,253
11 400 300,7 0,373
Khi nồng độ Eudragit tăng, kích thƣớc tiểu phân cũng tăng theo. Mẫu 11 và 12 có kích thƣớc và PDI lớn. Điều này có thể do hai nguyên nhân:
- Khi tăng lƣợng polyme, lớp vỏ của tiểu phân dày lên.
- Polyme thừa trƣơng nở và kết dính vào các tiểu phân làm tăng kích thƣớc trung bình, giảm độ đồng đều giữa các tiểu phân.
Mẫu 8 và 9 có kích thƣớc tiểu phân nhỏ nhất. Vì hai mẫu có kích thƣớc tiểu phân khác nhau không nhiều nhƣng mẫu 9 đồng đều kích thƣớc hơn nên khối lƣợng Eudragit 200 mg đƣợc chọn.
3.1.2.4. Lựa chọn chất nhũ hóa
Tiểu phân nano đƣợc hình thành sau khi dung môi bay hơi. Do đó kích thƣớc giọt nhũ tƣơng quyết định kích thƣớc tiểu phân. Chất nhũ hóa là thành phần quan trọng để hình thành nhũ tƣơng ổn định, có kích thƣớc giọt nhỏ. Vì vậy hệ nano fluconazol đƣợc bào chế với các chất nhũ hóa là Cremophor RH 40, Tween 80 và PVA. Các thành phần còn lại ghi ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Công thức bào chế nano fluconazol với các chất nhũ hóa khác nhau
Thành phần Số lƣợng
Pha nội Fluconazol
Eudragit RS 100 Diclomethan
100 mg 200 mg 7,5 ml
Pha ngoại Chất nhũ hóa
Nƣớc
Thay đổi 100 ml
Bảng 3.8: Kích thƣớc, thế Zeta của mẫu khi dùng các chất nhũ hóa khác nhau
Mẫu Chất diện hoạt Kích thƣớc (nm) PDI Thế Zeta (mV) 13 Cremophor RH 40 0,35% 208,0 0,296 +21,2
14 Tween 80 1% 236,8 0,429 +42,7
15 PVA 2% 229,0 0,114 +28,6
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy cả 3 mẫu đều có kích thƣớc tiểu phân tƣơng đƣơng nhau. Mẫu 14 có PDI lớn nhất, còn mẫu 15 có PDI nhỏ nhất. Các mẫu đều có thế
Zeta cao nên hạn chế sự kết tập tiểu phân. So với mẫu 13, mẫu 15 đồng đều về kích thƣớc hơn, thế Zeta lớn hơn nên PVA đƣợc chọn để làm chất nhũ hóa ổn định cho nhũ tƣơng.
3.1.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch PVA
Nồng độ PVA ảnh hƣởng đến khả năng tạo nhũ tƣơng, tốc độ sa lắng và lƣợng dƣợc chất thu đƣợc sau ly tâm. Các mẫu đƣợc bào chế có thành phần ghi trong bảng 3.7 với nồng độ dung dịch PVA ở pha ngoại thay đổi từ 0,5 đến 4%. Ngay sau khi bào chế, sản phẩm đƣợc đo kích thƣớc tiểu phân và thế Zeta. Kết quả đƣợc ghi ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Kích thƣớc, thế Zeta của mẫu với các nồng độ PVA khác nhau
Mẫu PVA Kích thƣớc (nm) PDI Thế Zeta (mV)
16 0,5% 189,3 0,143 +30,3
17 1% 146,7 0,183 +33,7
18 2% 207,3 0,170 +31,2
19 3% 210,3 0,082 +28,9
20 4% 224,8 0,176 +34,0
Ở nồng độ PVA 1% tiểu phân fluconazol có kích thƣớc nhỏ nhất. Ở nồng độ 0,5%, pha ngoại không đủ độ nhớt để ngăn sự kết tụ tiểu phân. Ở các nồng độ cao hơn 1%, độ nhớt cao là rào cản của quá trình nhũ hóa nên kích thƣớc tiểu phân lớn hơn. Các mẫu đều có thế Zeta cao trên +25 mV. Sự thay đổi nồng độ PVA không làm thay đổi đáng kể giá trị thế Zeta.
Mặt khác, kết quả xác định nồng độ của fluconazol trong pha ngoại sau ly tâm (mục 2.3.2) cho thấy khi tăng nồng độ PVA, lƣợng fluconazol tan trong pha ngoại tăng lên làm giảm hiệu suất quy trình (bảng 3.10). Vì vậy nồng độ PVA 1% đƣợc lựa chọn cho các mẫu nghiên cứu sau.
Bảng 3.10: Nồng độ fluconazol trong dịch ly tâm ở các nồng độ PVA khác nhau
Nồng độ PVA 1% 2% 3%
3.1.2.6. Khảo sát tỉ lệ thể tích giữa pha nội và pha ngoại
- Fluconazol tan cả trong nƣớc và dung môi thân dầu. Vì vậy, khi phân tán pha nội vào pha ngoại, một phần dƣợc chất khuếch tán vào nƣớc gây hƣ hao trong quá trình bào chế. Do đó độ tan của fluconazol trong nƣớc và diclomethan đƣợc xác định để giúp lựa chọn nồng độ fluconazol trong pha nội với mục đích đạt hiệu suất quy trình cao.
Độ tan của fluconazol ở điều kiện phòng thí nghiệm đƣợc xác định theo phƣơng pháp trình bày ở mục 2.3.2. Kết quả đƣợc ghi lại ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Độ tan của fluconazol trong diclomethan và nƣớc ở điều kiện phòng