Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh đo được : 215,5°C
Phổ tử ngoại cho đỉnh hấp thụ ở : 209,5nm ; 334nm; 443nm . Từ đó dự đoán cấu trúc kháng có nối đôi liên hợp , dị tố hoặc kết hợp các đặc điểm trên.
Phổ hồng ngoại cho thấy các bước songs hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 13.
Bảng 3.10 : kết quả IR. Đỉnh hấp phụ (cm-1) Nhóm chức đặc trưng 3437 Amin >NH 2961 - C - H của nhóm - CH3 2926 2857 1741 > C = O của vòng cyclopenthanon 1651 > C = C <
1584 liên kết trong muối amoni –NH3+
1464 - CH2 -
1379 nhóm - CH3 bất đối xứng
1296 nhóm - NO2-
1095 - C - O - C của ether béo
635 ≡ CH hoặc > C - X với X là Cl, Br
Phổ khối : Cho kết quả dự đoán khối lượng phân tử của kháng sinh là
1291,80160 đvC. Trong phân tử kháng sinh có thể có chứa các nguyên tố như trong bảng 14 dưới đây.
Bảng 3.11 : Kết quả dự đoán từ phổ MS Các nguyên tố Khối lượng chính xác Số nguyên tử nhỏ nhất Số nguyên tử cao nhất C 12.000000 0 80 H 1.007825 0 120 N 14.003074 0 6 O 15.994915 0 16 S 31.972071 0 4 Na 22.989770 0 1
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN:
Qúa trình nghiên cứu chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp và rút ra một số kết luận sau :
Tiến hành ĐB cải tạo giống theo các phương pháp khác nhau đã giúp tăng HTKS của KS được sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces 166.28. Môi trường lên men chìm tốt nhất là MT2dt
Kháng sinh thô thu được sau khi chiết từ dịch lọc và dịch lên men bằng dung môi n-Butanol ở pH 3 , được tách tốt nhất bằng hệ sắc ký cột với hệ dung môi 3 (Butylacetat : Ethanol : Triethylamin ( 1: 2: 1) ) . Để thu được kháng sinh tinh khiết cần tiếp tục chạy sắc ký lần 2 với hệ dung môi ( Ethylacetat : Methanol (15 : 1) ).
Có ít nhất 2 thành phần trong kháng sinh thô thu được. Hiệu suất tinh chế kháng sinh thu được là 17,45% trong đó : Hiệu suất tinh chế kháng sinh 1 (KS1) là 12,24%. Hiệu suất tinh chế kháng sinh 2 (KS2) là 5,21%
Kháng sinh thứ nhất ( KS1) tinh khiết thu được có một số đặc điểm sau:
Kháng sinh có nâu đỏ.
Có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram(-).
Trong dung môi methanol, kháng sinh hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho các đỉnh hấp thụ ở λ1 = 209.5nm, λ2 = 334nm và λ3 = 443 nm..
Biện giải phổ hồng ngoại, sơ bộ dự đoán kháng sinh có thể có các nhóm chức: amin, ceton, nitro, ether, có liên kết đôi, liên kết ba có thể có halogen.
Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh T0
nc = 215,5 0C.
ĐỀ XUẤT :
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:
- Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 166.28 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang,kỹ thuật gen …) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.
Nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về môi trường lên men để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh ; các điều kiện để tăng hiệu suất của từng kháng sinh trong hỗn hợp.
Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện chiết tách để thu được kháng sinh tinh khiết có hiệu suất cao hơn, dung môi an toàn.
Tiến hành biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) kết hợp với các phổ khác để xác định cấu trúc kháng sinh tổng hợp được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2.
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, trang PL129-PL131
3. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm , NXB Y học.
4. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật
5. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39-67
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục , trang 38-40
7. Lê Huy Dương (2011), Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh do
Streptomyces 156.11, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ , Đại học Dược Hà Nội.
8. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nâm gây bệnh trên cây trè ở thái nguyên , luận văn thạc sĩ học, Đại học sư phạm Thái Nguyên.
9. Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 2.
10.Nuyễn Phương Nhuận , Nguyễn Văn Hiệu, Lê Gia Hy ( 2009 ), Nghiên cứu tối ưu môi trường lên men chủng Streptomyces Ỏientalis 4912 sinhvancomycin , Tạp chí khoa học và công nghệ , tập 47, số 6 , trang 25-34.
11.Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách , phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật , Hà Nội, taapj1, trang 9-27.
12.Khuất Hữu Thanh (2005), cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen , NXB Khoa học kỹ thuật , Hà Nội , trang 185-191
13.Nguyễn văn thanh (2009), Cộng nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục , Hà Nội, trang 14-57.
14.Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, Hà Nội , trang 9-49.
15.Cao Văn Thu, Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Liên Hương , Nuyễn Lệ Phi (2008), Vi sinh vật học, NXB giáo dục , Hà Nội
16. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 2.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh.
17.David A. Hopwood (2007), Streptomyces in nature and medicin, Oxford
university press, United States of America.
18.Donald L.Pavia, Gary M. Lampman, George S.Kriz (1996), Introduction to Spectrocopy, Thomson Learning, Washington, USA.
19.Kino T, Hatanaka H, Hashimoto M, Nishiyama M, Goto T, Okuhara M, Kohsaka M, Aoki H, Imanaka H (1987), FK-506, “A novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I. Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics”, The Journal of antibiotics, vol XL , pages 1249 – 1255.
20.Kekuda, T.R.P., K.S. Shobha and R. Onkarappa, (2010). Fascinating diversity
and potent biological activities of Actinomycete metabolites, J. Pharm. Res.,
page 250-256.
21.Poulsen M, Oh DC, Clardy J, Currie CR (2011), Chemical analyses of wasp- associated Streptomyces bacteria reveal a prolific potential for natural products discovery, Department of Bacteriolodi, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, United States of America . [pubmed].
Hình P.1: Hình thử HTKS bằng phƣơng pháp khối thạch.
Hình P.3 : Hình thử HTKS bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc.