3.1.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược Uệu
❖ Đinh tính alcaloid
Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm dược liệu bằng dd amoniac đặc. Đậy kín trong 30 phút để khô tự nhiên. Cho 15ml chloroform lắc đều, ngâm 12 giờ. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn.
S a u đ ó l ắ c k ỹ v ố i lO m l d d H 2 S O 4 I N . G ạ n l ấ y d ị c h c h i ế t a c i d , c h o v à o 3 ố n g
nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết.
- Ống 1: Nhỏ 2- 3 giọt TT Mayer - Ống 2: Nhỏ 2- 3 giọt TT Dragendorff - Ống 3: Nhỏ 2- 3 giọt TT Bouchardat
Nhận x é t Qua kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu không có alcaloid.
❖ Đinh tính flavonoỉd
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thuỷ 10 phút, lọc nóng. Bốc hơi hết cồn, thêm 15ml nước cất đun sôi cho tan hết, để nguội, để tủ lạnh 12h. Lọc, gạn lấy dịch nước làm phản ứng định tính:
- Phản ứng Cyanidin:
Cho 2ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại, thêm 3 giọt H Q đặc. Lắc đều rồi đun cách thuỷ vài phút.
Kết quả: Thấy xuất hiện màu hồng (Phản ,ứng dương tính)
- Phản ứng vói kiềm:
* Nhỏ 1 - 2 giọt dịch chiết lên một tờ giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Hơ lên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nắp. Thấy màu vàng đậm dần lên. * Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết. Thêm vài giọt dd NaOH 10% thấy xuất hiện tủa và màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt (Phản ứng dưoỉng tính)
- Phản ứng vói dd PeQg 5% ;
Cho vào ống nghiêm 1 ml dịch chiết, thêm 2- 3 giọt dd PeQg 5% thấy xuất hiện tủa màu xanh đen (Phản ứng dương tính)
Nhận xét: Qua kết quả trên sơ bộ kết luận trong dược liệu có Aavonoid.
❖ Đinh tính saponin;
- Hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 0.5g bột dược liệu, thêm 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm lOml nước. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiêm. Để yên trong 15 phút.
Kết quả: Sau 15 phút thấy cột bọt bền vững (Phản ứng dương tính)
- Phản ứng Salkowski:
Bốc hơi dịch chiết saponin tới cắn. Thêm Iml chloroform, lắc cho tan cắn. Thếm Iml acid sulfuric đặc, lắc đều.
Kết quả: Thấy xuất hiện màu đỏ.
- Phản ứng sơ bộ phân biệt hai loại saponin: + Phản ứng tạo cột bọt trong môi trường acid và base:
Cho vào ống nghiệm lớn 0.5g bột dược liệu, thêm 5ml cồn 90°. Đun cách thuỷ đến sôi, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các thí nghiệm:
• Ống 1: Cho 5ml dd NaOH 0. IN và 5 giọt dịch lọc. • Ống 2: Cho 5ml dd HCl O.IN và 5 giọt dịch lọc.
Lắc đều cả hai ống nghiệm trong 1 phút, để yên quan sát cột bọt trong hai ống nghiệm.
Kết quả: Cột bọt trong ống 2 cao hơn so vói cột bọt trong ống 1.
+ Phản ứng Liberman- Burchardat:
Cho Iml anhydiid acetic vào ít dịch chiết methanol. Đun nóng nhẹ, thêm một giọt H2SO4 đặc. Lắc đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả: Thấy xuất hiện màu đỏ.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu có chứa s a p o n i n triterpenoid.
❖ Đinh tính anthranoid
- Phản ứng Bontrager:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50ml dd H2SO4
10%, đun sôi cách thuỷ trong 15 phút, Lọc nóng vào bình gạn. Để nguội rồi lắc vói 5ml chloroform. Gạn lấy phần chloroform cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết.
• Ống 1: Thêm Iml dd NH4OH 10%, lắc kỹ, để yên. Thấy lớp dịch amoniac không có màu hồng (Phản ứng âm tính).
• Ống 2: Thêm Iml dd NaOH 10%, lắc kỹ. Thấy lớp kiềm không có màu hồng (Phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa:
Qio Ig bột dược liệu vào nắp nhôm. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đèn cồn. Sau 5- 10 phút, lấy lam kính ra để nguội. Soi dưới kính hiển vi, không thấy có tinh thể (Phản ứng âm tính)
Nhận x é t Sơ bộ kết luận trong dược liệu k h ô n g có antthranoid.
❖ Đinh tính glvcosid tim
Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 60ml cồn 20°, lắc đều để qua đêm. Gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng dd chì acetat 30% dư. Để lắng, lọc, lấy dịch lọc. Loại chì acetate thừa trong dịch lọc bằng thêm dd Na2SƠ4 bão hoà đến khi không còn tủa với Na2SƠ4 nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 3 lần vói chloroform, mỗi lần lOml. Gộp dịch chloroform vào cốc có mỏ, bốc hoi cách thuỷ đến khô. Hoà tan cắn trong 5ml cồn 90° để làm phản ứng.
- Phản ứng Liberman:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến cắn. Thêm Iml anhydride acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 45°, thêm từ từ theo thành ống Iml dd H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm phân thành 2 lớp.
Kết quả: Không thấy xuất hiện vòng đỏ tím giữa lớp phân cách. Lắc nhẹ ống
nghiệm, lớp chất lỏng phía trên không có màu xanh lá cây (Phản ứng âm tính) - Phản ứng Baljet:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0.5ml TT Baljet mới pha (gồm 1 phần dd acid picric 1% và 9 phần dd NaOH 10%)
Kết quả: Dung dịch thử không chuyển màu (Phản ứng âm tính)
- Phản ứng Legal:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dd NaOH 10%, lắc đều.
Kết quả: Không th% xuất hiện màu đỏ tím (Phản ứng âm tính)
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có glycosid tim.
❖ Đinh tính coumarỉn
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón lOOml, thêm 30ml cồn 90°. Đun cách thuỷ sôi 5 phút. Lọc nóng, bốc hơi hết cồn. Thêm 20ml nước, đun sồi cho tan hết, để nguội, để tủ lạnh 1 2h, gạn, lọc lấy dịch nước, lắc với chloroform 2 lần (mỗi lần lOml). Gộp dịch chloroform lại, bốc hoi tới cắn. Thêm lOml cồn 90°, lắc kỹ cho hoà tan cắn, dịch thu được dùng làm phản ứng:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mối ống Iml dịch chiết: • Ống 1: Thêm 0.5ml dd NaOH 10% • Ống 2: Để nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy: • Ống 1: Tủa đục.
• Ống 2: Trong.
Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, thấy: • Ống 1: Trong suốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Ống 2: Có tủa đục.
Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ đục trở lại như ống 2 (Phản ứng dương tính)
- Phản ứng diazo hoá
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm 2ml dd NaOH 10%. Đun cách thuỷ sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử diazo mói pha, thấy xuất hiện màu đỏ gạch (Phản ứng dương tín h ).
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu có coumarin.
❖ Đinh tính tannin
Cho vào ống nghiệm Ig bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất trong bình nón 50ml, đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết.
- Phản ứng với FeClj
Ống 1; Thêm 2- 3 giọt dd FeClj 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen. - Phản ứng với gelatin
Ống 2: Thêm 2- 3 giọt dd gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa đục. - Phản ứng với Pb(CH3COO)2
Ống 3: Thêm 2- 3 giọt dd Pb(CH3COO)2 10% thấy xuất hiện tủa đục.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có tannin.
❖ Đinh tính acid hữu cơ
Cho Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất. Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2C0 3 , thấy có bọt khí bay lên (Phản ứng dưcỉng tính)
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu có acid hữu cơ.
❖ Đinh tính acid amin
ƠIO Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất, đun sôi 5 phút. Lọc nóng, lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm khác, thêm 2- 3 giọt TT ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10 phút, không thấy xuất hiện màu tím (Phản ứng âm tính)
Nhận x é t: Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có acid amin.
❖ Đinh tính đường khử
Cho 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B. Đun cách thuỷ 10 phút, thấy có tủa đỏ gạch (Phản ứng dương tính)
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu có đường khử.
❖ Đinh tính chất béo
Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hoả, ngâm qua đêm, lọc. Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc (Phản ứng âm tính)
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có chất béo.
❖ Đinh tính steroid
Qio vào ống nghiệm Iml dịch chiết ether dầu hỏa trên. Bốc hod dung môi đến cắn. Thêm vào ống nghiệm Iml anhydride acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm Iml H2SO4 đặc theo thành ống nghiêm, thấy mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng không có màu xanh (Phản ứng âm tính)
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong dược liệu k h ô n g có steroid.
❖ Đinh tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hoả trên. Bốc hơi cách thuỷ đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy ống nghiệm chuyển sang màu xanh da trời (Phản ứng âm tính)
Nhận x é t Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có caroten. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
❖ Đinh tính polvsaccharid
Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm lOml nước cất, đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng. Cho vào 2 ống nghiệm :
- Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol - Ống 2; 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol
( TT Lugol được pha như sau; Lấy 0.5g I2 và l.Og KI pha trong lOOml nước cất. Đựng trong lọ màu)
Quan sát thấy ống 1 màu vàng đậm hofn ống 2.
Nhận xét. Sơ bộ kết luận trong dược liệu có polysaccharid.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ được trình bày tóm tắt trong bảng 1:
Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong Chỉ thiên
'1'1' Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luân
1 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer -
Phản ứng v ó i Dragendorff - Không có
Phản ứng với '1'1' Bouchardat -
2 Flavonoid Phản ứng Cyanidin ++
Phản ứng với kiềm + Có
Phản ứng với FeCl, 5% +++
3 Saponin Hiện tượng tạo bọt +++
Phản ứng Salkowski +++ Có
Phản ứng phân biệt hai loại Saponin
saponin triterpenoid
4 Anthranoid Phản ứng Bomtrager - Không có
Vi thăng hoa -
5 Glycosid tim Phản ứng Liberman -
Phản ứng Baijet - Không có
Phản ứng Legal -
6 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton ++
Phản ứng với thuốc thử Diazo + Có
7 Tanin Phản ứng vói FeQg +++
Phản ứng với gelatin - Không có
Phản ứng với Pb(CH,COO), +++
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na,C0 .3 +++ Có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 Acid amin Phản ứng^với T1' Ninhydnn - Không có
1 0 Đường khử Phản ứng với 'IT Fehling +++ Có
1 1 ơ iấ t béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có
1 2 Steroid Phản ứng Liberman - Không có
13 Caroten Phản ứng với H9SO4 đặc - Không có
14 Polysaccharid, Phản ứng với TT Lugol + Có
Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính (+) ; Phản ứng dương tính (++) : Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhân xét: Qua các phản ứng định tính ở trên, chúng tôi sơ bộ kết luận trong
cây Chỉ thiên có chứa: saponin, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử
và polysaccharid. Do đó hưổng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào nhóm saponin và flavonoid trong cây Chỉ thiên.
3.1.2.2. Nghiên cứu về saponin
♦t* Xác đinh chỉ số tao bot
Cân 40g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 500ml thêm lOOml nước, đun sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đủ lOOml.
Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, ... , 10 ml dịch chiết, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10 ml. Lắc các ống nghiệm theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Cách tiến hành thí nghiệm ghi ở bảng 2. Bảng 2: Thí nghiệm xác định CSB Ang 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Dịch chiết saponin (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Nước cất (ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Thể tích (ml) 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0
Qiỉ số bọt được tính theo công thức:
h x C
Trong đó:
h : Ống có cột bọt cao 1 cm c : Nồng độ nước sắc
Kết quả: Cột bọt trong ống nghiệm số 9 có chiều cao 1 cm Vậy chỉ số tạo bọt của dược liệu là 2.78
❖ Đinh lương saponin toàn phần:
* Chiết xuất:
Cân chính xác khoảng lOg bột dược liệu, chiết Soxhlet vói ether dầu hoả để loại tạp. Để dược liệu khô tự nhiên, chiết tiếp bằng methanol 80% đến hết saponin (Thử bằng phản ứng Salkowski). Dịch chiết thu được cất thu hồi methanol, cao lỏng còn lại pha loãng bằng nước nóng, để nguội, để tủ lạnh, lọc loại các tạp chất không tan. Dịch thu được lắc vói ether dầu hoả 3 lần, đun nóng đuổi hết ether dầu hoả. Để nguội, lắc vói n- Buthanol nhiều lần đến khi lớp n- Buthanol trong, thu hồi n- Buthanol được cắn. Hoà tan cắn trong một lượng tối thiểu methanol, thêm từ từ một lượng aceton gấp khoảng 1 0 lần, saponin kết tủa để lắng, lọc thu lấy tủa. Dịch lọc cho thêm lượng aceton khác vào để kết tủa hết saponin. Gộp các tủa lại để định lượng. Quá trình chiết xuất được tóm tắt ở hình 13.
Hình 13: Chiết xuất saponin toàn phần
* Định lượng:
Sau khi tiến hành chiết xuất theo quy trình trên, thu được tủa s. Sấy tủa ở 80°c tói khối lượng không đổi, cân và tính kết quả.
Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:
a
%) = • -xioo
/ n x ( l - ố )
Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
s : hàm lượng saponin toàn phần tính theo dược liệu khô tuyệt đối (%) a : khối lượng cắn saponin (g)
m ; khối lượng dược liệu đem chiết (g) b : hàm ẩm của dược liệu (%)
Song song tiến hành xác định độ ẩm dược liệu.
Định lượng saponin toàn phần với 6 mẫu và cho các kết quả như bảng 3.
Bảng 3: Kết quả định lượng saponin toàn phần
ST'l' Khối lượng dược liệu (g) Hàm ẩm dươc liêu (%)'
Khối lượng saponỉn toàn phần (g) Hàm lượng saponin toàn phần (%) 1 9,9212 13,15 0,1702 1,98 2 9,9885 13,15 0,1801 2,07 3 9,9705 13,15 0,1713 1,98 4 9,8116 10,64 0J650 1,88 5 9,9103 10,64 0,1688 1,90 6 9,8157 10,64 0,1702 1,94 Trung bình 1,95
Nhận xét: Hàm lượng saponin toàn phần trong cây Chỉ thiên tính theo dược
liệu khồ tuyệt đối là 1,95 ± 0,07 %
* x * Đinh tính saponin bàng sác ký lởp mỏng
- Dịch chấm sắc ký: cắn saponin định lượng à trên hoà tan trong methanol để chấm sắc ký.
- Bản mỏng: Silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn, hoạt hoá ở 110°c trong 1 giờ.
- Hệ dung môi: Tiến hành khảo sát trên một số hệ dung môi dể chọn hệ tách tốt hơn cả. Các hệ dung môi khảo sát gồm:
SI : n- Buthanol bão hoà nước
S2 : n- Buthanol: Acid acetic : Nước [ 4 : 1 : 1 ] S3 : Chloroform : M ethanol: Nước [65 : 35 : 10]
S4 : Cyclohexan: Ethylacetat [4 : 6 ]
S5 : Chloroform : Ethyl acetat: Methanol [ 9 : 1 : 1 ]
S6 : Benzen : Aceton [9 : 1]
S7 : Benzen: Methanol [9 : 1]
S8 : Chloroform: Methanol [19:1 ]
S9 : Chloroform; Aceton [9 : 1]
SIO : Chloroform: Ethylacetat [ 9 :1 ]
S l l : n- Hexan : Aceton [4: 1]
S12 : n- Buthanol; Ethylacetat: Nước [ 4 : 1 : 5] S13 : Toluen : Ethylacetat: acid formic : Nước [ 6 : 5 : 1,5 : 1]
Sau khi bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, bản mỏng được soi u v ở bước sóng 365 nm.
- Hiện màu bằng các thuốc thử:
+ TTSl ; Vanilin 1% trong cồn + 2ml H2SO4 đặc. + TTS2 : Hơi iod
Sau khi phun thuốc thử TTSl, bản mỏng được sấy ở 110°c trong 10 phút. - Kết quả:
+ Hệ S5 cho kết quả tách tốt hơn cả với 7 vết. + Thuốc thử TTSl cho kết quả hiện màu tốt nhất.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});