2.I.3.I. Chế tạo hệ nano piroxicam
Chế tạo hệ nano piroxicam bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi từ nhũ tưong. Quá trình gồm 3 bước:
Tạo dung dịch dược chất và poỉyme: hòa tan piroxicam và Eudragit trong
dicloromethan (dung dịch 1).
Tạo nhũ tương dầu/nước:
+ Nhỏ từ từ dung dịch 1 vào ứong dung dịch PVA trong nước có nồng
độ từ 0,5-5,0%.
+ Làm lạnh môi trưòng bằng nước đá, nhiệt độ được kiểm soát trong 5-
10°c.
+ Khuấy trộn liên tục bằng máy khuấy.
Loại dung môi:
+ Loại dung môi dicloromethan bằng cách khuấy trộn liên tục ở tốc độ
chậm bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
+ Loại nước bằng cách ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 15 phút, dịch
phía trên được tập trung tiếp tục ly tâm trong 15 phút để thu được các hạt. Rửa tủa 3 lần với nước cất bằng cách phân tán tủa trong nước và ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút. Sau đó, để khô ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
2.1.3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng việc tạo thành hệ nano:
Ảnh hưởng của thiết bị đồng nhất hóa Homogenizer FBF101: chế tạo mẫu piroxicam với Eudragit RSIOO, RLIOO, SIOO với tỷ lệ 1:2,5, nồng độ PVA 0,5% không sử dụng hoặc sử dụng máy đồng nhất hóa Homogenizer FBF101.
Ảnh hưởng của tỷ lệ chất nhũ hóa PVA: chế tạo các mẫu piroxicam với chất mang Eudragit RSIOO, RLIOO, SIOO tỷ lệ 1:2,5, mẫu trắng Eudragit RSIOO và mẫu chứng piroxicam nồng độ PVA trong nước 0,5%, 1,5%, 3% và 5%.
Ảnh hưcmg của các chất mang và tỷ lệ chất mang: chế tạo các mẫu piroxicam và các chất mang khác nhau (Eudragit RLIOO, Eudragit RSIOO và Eudragit SIOO), với các tỷ lệ dược chất và chất mang khác nhau (1:2,5, 1:5, 1:10).
Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên hình thái, cấu trúc tiểu phân, kích thước và phân bố kích thước (phương pháp trình bày cụ thể ở mục 2.1.3.4).
2.1.3.3. Theo dối độ ổn định kích thước tiểu phân:
Chế tạo mẫu piroxicam với công thức tốt nhất để theo dõi độ ổn định về kích thước trong các điều kiện bảo quản khác nhau. Mầu chia thành 3 phần để trong lọ tíiủy tinh nút cao su siết chặt bằng nút nhôm để trong 3 điều kiện: điều kiện nhệt độ phòng, điều kiện trong tủ vi khí hậu, điều kiện khắc nghiệt (ngoài trời) trong thời gian 3 tháng. Sau thời gian 3 tháng các mẫu được xác định phân bố kích thước so sánh với phân bố kích thước của mẫu ngay sau khi chế tạo.
2.1.3.4. Phương pháp đánh giá hệ nano:
a. Đánh giá cấu trúc và kích thước hệ nano bằng kích hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Nguyên tắc: dùng các chùm điện tử, đi qua mẫu vật để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, hiện ảnh lên màn hình huỳnh quang để có độ phóng đại theo yêu cầu.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 có các thông số: độ phóng đại M = x50-x600000, độ phân giải 5=3 A°, điện áp gia tốc ư=40-100 kv.
b. Đánh giá hình thái và kích thước hệ nano bằng kính hiển vi điện í ử quét (SEM)
Nguyên tắc: chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu được thu lại bởi các đầu dò để biển đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt, thành phần của mẫu đưa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh 3 chiều.
Sử dụng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S-4800 có độ phóng đại M=20x- SOOOOOx; độ phân giải 5=1,0 nm; điện áp gia tốc U=0,5-30 kv.
c. Đánh giá kích thước và phân bố kích thước bằng máy xác định phân bố kích thước tiểu phân
Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ lade. Nguyên lý của phương pháp là khi chiếu chùm tia lade vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào hạt ta có thể tính được kích thước hạt theo thuyết Mie [17]. Phương pháp tán xạ lade đưa ra kết quả tỷ lệ phần trăm thể tích của các hạt theo đường kính hạt.
Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Horiba LA-95 đo kích thước hạt trong khoảng 0,011-3000,000 |xm. Điều kiện đo: hệ số tán xạ ánh sáng (Refractive index) là 1,390.
d. Đánh giá thế zeta bằng máy đo thế zeta
Nguyên tắc: thế zeta thưòng được xác định bằng phương pháp điện di trên thiết bị bao gồm kính hiển vi để theo dõi quãng đường di chuyển của tiểu phân tích điện trong điện trường giữa hai điện cực platin. Thời gian được tự động hóa gắn trong thiết bị đo [2], [3], [17]. Thế zeta của các hệ phân tán trong dung dịch đo trên thiết bị Zeta Photometer IV - CAD dựa trên nguyên lý của hiện tượng điện di. Giá trị thế zeta được đo tính theo công thức Smoluchowsky:
^ x C / x 300x300x1000
s
+ u = —^ ; độ di chuyển của hạt trong điện trường
E / L
+ E: điện thế áp vào hệ đo
+ L: khoảng cách giữa hai điện cực (cm)
Điều kiện đo; nhiệt độ: 25 ± 2°c, độ dẫn điện: 0,017 mS/cm, pH: 7.
e. Phân tích nhiệt vi sai
Phương pháp phân tích nhiệt là phưcmg pháp phân tích mà trong đó các tính chất vật lý, hóa học đo liên tục theo hàm của nhiệt độ (nhiệt độ thay đổi có quy luật) [16]. Phân nhiệt vi sai (DTA) dựa trên sự thay đổi nhiệt độ mẫu đo và mẫu chuẩn, biểu diễn dưới dạng hàm của nhiệt độ. Quét nhiệt vi sai (DSC) là phương pháp mà chênh lệch nhiệt độ giữa mẫu đo và mẫu chuẩn luôn bằng không.
Các mẫu phân tích DSC đo trên máy SETARAM DSC 131 của Australia. Các
mẫu (4 mg) được cho vào trong đĩa nhôm có nắp. Nhiệt độ quét từ 25°c - 220^^0,
với tốc độ 20°c/phút.
f. Định lượng
+ Xác định hàm lượng pỉroxỉcam trong mẫu nano Phương pháp đo quang:
Đo quang phổ UV-VIS để xác định lượng dược chất piroxicam trong mẫu nano. Cân chính xác một khối lượng mẫu nano tương ứng với khoảng 50 mg piroxicam, hòa tan vào dicloromethan, lọc, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Đo
mật độ quang của dung dịch này ở bước sóng x=326 nm. Tiến hành các bước tương
tự với dung dịch chuẩn piroxicam biết trước nồng độ. Tính kết quả bằng phương pháp so sánh với mật độ quang của dung dịch chuẩn piroxicam trong dicloromethan.
Dựa vào mật độ quang đo được, xác định hàm lượng phần trăm piroxicam trong mẫu nano, theo công thức:
x = — X X100
^ c h u a n ^ n a n o
Trong đó:
4- X: Hàm lượng phần trăm piroxicam trong mẫu nano tạo thành.
+ Dchuan: Mật độ quang của dung dịch piroxicam đã biết trước nồng độ. + nichuan: Khối lượng piroxicam đem đo mật độ quang.
+ ninano: Khối lượng mẫu nano đem đo mật độ quang.
Mỗi công thức làm 3 mẫu và định lượng mỗi mẫu 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Phương pháp HPLC;
Cân chính xác một khối lượng mẫu nano tương ứng khoảng 50 mg piroxicam hòa tan trong 100 ml methanol 0,01N hydroclorid. Pha loãng trong methanol 0,01N
hydroclorid tới nồng độ thích hợp. Mau được sắc ký pha đảo với pha tĩnh là cột c 18
25cmx4,6 |im, pha động là hỗn họp methanol và đệm (7,72 gam acid citric khan và 5,35 gam dinatri hydro phosphat khan trong 1000 ml nước). Tốc độ dòng là 1,2 ml/phút, detector 254 nm. Các bước tiến hành tương tự với dung dịch piroxicam biết trước nồng độ.
Tính kết quả bàng phương pháp so sánh dựa vào diện tích píc dung dịch chuẩn piroxicam.
Công thức: X = ^ ^ x ^ ^ x l O O
chuan ^nano
Trong đó:
+ X: Phần trăm khối lượng piroxicam trong mẫu nano piroxicam. + Snano^ diện tích píc mẫu nano piroxicam.
+ Schuan: diện tích píc piroxicam chuẩn. + ninano: khối lượng mẫu nano HPLC. + nichuan: khối lượng piroxicam chuẩn.
Mỗi công thức làm 3 mẫu và định lượng mỗi mẫu 3 lần, lấy kết quả trung bìnli
2.2. KÉT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thiết bị và tá dược đến sự hình thành và cấutrúc của hệ nano trúc của hệ nano
Các hệ nano được chế tạo theo phưong pháp trình bày ở mục 2.3.1.1 với các thành phần như sau;
Thành phân Tỷ lệ Hỗn hợp piroxicam và Eudragit 600 mg (1:2,5, 1:5 và 1:10) Dicloromethan 5 ml Ethanol 2,5 ml Alcol polyvinic 0 , 5 - 1 , 5 - 3 - 5 % Nước cât 200 ml
+ Mâu thử: Piroxicam và Eudragit RSIOO, RLIOO và SIOO ở các tỷ lệ 1:2,5; 1:5; 1:10.
+ Mau trắng: không có piroxicam (EuRS-DC, EuRL-DC, EuS-DC) + Mau chứng; không có Eudragit (Px-DC)
+ Piroxicam nguyên liệu (Px)
• Bột phân tán thành lớp mỏng trên miếng lưới đồng có mắt lưới rất nhỏ đã thấm ẩm bằng dung dịch Bacitracin, soi và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
• Bột phân tán thành lớp mỏng trên một lớp keo dẫn điện, phủ một lớp Platin, soi và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét.
• Bột phân tán trở lại trong nước cất và đo phân bố kích thước hạt bằng máy phân tích kích thước hạt.
2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thiết bị: máy khuấy, máy đồng nhất hóa Homogenizer FBF 101
Các mẫu piroxicamrEudragit RS 1:2,5, piroxicam:Eudragit RL 1:2,5,
piroxicam:Eudragit s 1:2,5, mẫu trắng Eudragit RSIOO và mẫu chứng piroxicam
được chế tạo theo phưong pháp mô tả ở mục 2.1.3.1 với giai đoạn nhũ hóa trong hai
điều kiện khác nhau:
+ Sử dụng máy khuấy.
+ Sử dụng máy khuấy, sau đó tiếp tục đưa qua máy đồng nhất hóa FBF101, 20 vòng ở áp suất 200 bar.
r F r F
Bảng 2.1 Anh hưởng của thiêt bị đên hình dạng, câu trúc hạt sau khi chê tạo
Mầu Hình dạng, câu trúc hạt sau khi chê tạo
Máy cánh khuây Máy cánh khuây+máy đông
nhất hóa
Mầu chứng (piroxicam) Hình dạng hạt: 0
Cấu trúc: hạt dược chất
Hình dạng hạt: «O 0 Cấu trúc: hạt dược chất
Mâu trăng Eud RS100 Hình dạng hạt:
Cấu trúc: hạt polyme Hình dạng hạt: 0 ữ Cấu trúc: hạt polyme Piroxicam :Eud RS 1:2,5 (PERS 2,5) Hình dạng hạt: o 0 Cấu trúc: hạt polyme bao dược chất xen lẫn với hạt polyme và hạt dược chất
Hình dạng hạt: 0 ^
Cấu trúc: hạt polyme bao dược chất, hạt dược chất.
PiroxicamiEud RL 1:2,5 (PERL 2,5)
Tương tự PERS 2,5 Hình dạng hạt; 0 0 ữ
Cấu trúc: hạt polyme bao dược chất, hạt dược chất
PiroxicamiEud s 1:2,5
(PES 2,5)
Tương tự PERS 2,5 Hình dạng hạt; o 0 Ỡ
Cấu trúc; hạt polyme bao dược chất, hạt dược chất
Ký hiệu: Hình cầu: 0 Hình oval: o Hình Iclối chữ nhật; 0
Đám kết dính:
Piroxicam nguyên liệu ban đầu (Px-NL) có dạng tinh thể hình khối, có kích thước trung bình khoảng 10 Ịim. Các mẫu chỉ sử dụng máy khuấy trong quá trình chế tạo có các hạt hình khối chữ nhật, đám polyme kết dính. Các mẫu sử dụng cả máy khuấy và máy đồng nhất hóa kích thước hạt nhỏ hơn, hạt ở dạng hình cầu, giảm hạt hình khối và các đám polyme kết dính.
KT (jiiiii) 9 5 7 6 5 4 3 2 1 O 1 0 Cáiili Idiiiây ® CaiiJi kJiiiavtdong nhắt i*
Px-NL Px-DC EuRS-DC PERS2.5 PERL2.5 PES2.5 Mau
Hình 2.1 Biểu đồ so sánh kích thước các mẫu hạt
Lực phân tán của máy cánh khuấy không đủ mạnh để phân tán tốt pha dầu vào pha nước, kết quả là không tạo ra được các hạt hình cầu, kích thước hạt trung bình lớn. Ngược lại, máy đồng nhất hóa bằng áp suất cao có khả năng phân tán tốt, tạo ra các hạt hình cầu xen lẫn hạt hình khối và đám kết dính, kích thước trung bình hạt nhỏ hơn. Vì vậy, máy đồng nhất hóa Homogenizer FBF101 được dùng để chế tạo mẫu tiếp theo.
2.2.I.2. Ảnh hưởng tỷ lệ chất nhũ hóa
Chế tạo các mẫu gồm piroxicam và Eudragit (RSIOO, RLIOO, SI00) với tỷ lệ 1:2,5, mẫu trắng Eudragit RSIOO và mẫu chứng chỉ có piroxicam với tỷ lệ PVA trong các mẫu là: 0,5; 1,5; 3; 5%. Sản phẩm thu được có hình dạng, kích thước hạt
Bảng 2.2 Anh hưởng của nông độ PVA
Mầu Hình dạng hạt sau khi chế tạo
0,5% 1,5% 3% 5% Máu chứng piroxicam (Px-DC) o Tưong tự mẫu 0,5% o Tương tự mẫu 3% Mẫu trăng Eud RS (EuRS-DC) Tương tự mẫu 0,5% o Tương tự mẫu 3% Piroxicam:Eud RS 1:2,5 (PERS2,5) o o ¿5-
Polyme bao dược chất, hạt dược chất Tương tự mẫu 0,5% o <5- Polyme bao dược chất, hạt dược chất o Polyme bao dược chất, hạt dược chất PiroxicamiEud RL 1:2,5 (PERL2,5) o ỡ < 5 -, Polyme bao dược chất, hạt dược chất Tương tự mẫu 0,5% o 0 Polyme bao dược chất, hạt dược chất o Polyme bao dược chất, hạt dược chất Piroxicam:Eud s 1:2,5 (PES2,5) o o ỡ o
Polyme bao dược chất, hạt dược chất Tưomg tự mẫu 0,5% o o Polyme bao dược chất, hạt dược chất o Pol)one bao dược chất, hạt dược chất
Ký hiệu: Hình câu: o Hình oval: o Hình khối chữ nhật: Q)
Đám kết dính:
Kết quả thực nghiệm cho thấy PVA ảnh hưởng đến cả hình dạng, kích thước và bề mặt của hạt sau khi chế tạo. Khi tăng các tỷ lệ PVA trong giai đoạn nhũ hóa thì số lượng các tinh thể hình hộp ở tất cả các mẫu giảm hẳn, số lượng hạt hìnli cầu
tăng lên, bề mặt hạt nhẵn, kích thước hạt nhỏ hơn và polyme bao ngoài dược chất. Kích thước hạt ở mẫu sử dụng 5% PVA nhỏ hơn mẫu sử dụng 0,5% PVA từ 2 đến 5 lần. Điều này có thể giải thích là do nồng độ chất diện hoạt tăng thì khả năng nhũ hóa tăng lên, các giọt chất lỏng trong nhũ tương nhỏ đi, hệ ổn định hơn trong quá trình bay hơi pha dầu để tạo hạt. Mau sử dụng dung dịch PVA 5% tạo ra các hạt hình cầu bề mặt nhẵn, kích thước nhỏ nhất, đồng đều nhất và không thấy các đám polyme kết tụ. Vì vậy nồng độ PVA 5% được sử dụng để chế tạo hệ nano trong các nghiên cứu tiếp theo.
KT (niii) 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,5" 0 m3% ' ị ' í
Px-DC EuRS-DC PERS2.5 PERL2.5 PES2.5 Mau
Hình 2.2 Biểu đồ so sánh kích thước các mẫu chế tạo vói nồng đồ PVA khác nhau
2.2.I.3. Ảnh hưửng của tá dược và tỷ lệ tá dược
Chế tạo các mẫu piroxicam với các polyme khác nhau Eudragit RSIOO, Eudragit RLIOO, Eudragit SIOO với các tỷ lệ là: 1:2,5; 1:5; 1:10 theo phương pháp mô tả ở mục 2.1.3.1. Các mẫu sau khi chế tạo được xác định hình thái, cấu trúc và kích thước hạt.
a. Eudragit RSlOO
Hinh thái, cấu trúc và kích thước của các hạt trong mẫu piroxicam chế tạo với Eudragit RS100 thể hiện trong bảng 2.3 và hình 2.3.
Bảng 2.3 Đặc điểm hệ nano với chất mang Eudragit RSlOO
Mau Hình thái, câu trúc, kích thước
Piroxicam:Eud RS 1:2,5
(PERS2,5)
Hình cầu đều, bề mặt nhẵn, ít hạt tinh thể xen kẽ
Kích thước hạt trung bình là 1000,75 nm, 49,8% hạt có kích
thước nhỏ hơn 1000 nm
Hạt polyme bao lấy dược chất, hạt dược chất Piroxicam:Eud
RS 1:5 (PERS5)
Hình câu đêu, bê mặt nhăn, không có tinh thê, ít có đám hạt kêt tụ với nhau
Kích thước hạt trung bình là 725,6 nm, 78,6% hạt có kích thước
nhỏ hơn 1000 nm
Hạt polyme bao lấy dược chất Piroxicam: Eud
RS 1:10 (PERSIO)
Hình câu đêu, bê mặt nhăn, có đám polyme kêt dính
Kích thước hạt trung bình là 573,25 nm, 79,2% hạt có kích
thước nhỏ hơn 1000 nm
Hạt polyme bao lấy dược chất và các hạt polyme không chứa dược chất
Các mẫu piroxicam chế tạo với Eudragit RSlOO đều có các hạt dạng cầu, bề mặt nhẵn, polyme bao ngoài dược chất, mẫu piroxicam:EudRS 1:2,5 có chứa nhiều hạt dược chất không có polyme và mẫu piroxicam;EudRS 1:10 có tỷ lệ lớn các hạt polyme riêng biệt. Nguyên nhân là khi tỷ lệ polyme thấp lượng polyme không đủ bao dược chất, khi tỷ lệ polyme tăng lượng polyme thừa ra tạo các hạt polyme tự do. Các mẫu hạt có kích thước trung bình nhỏ hơn 1000 nm. Mầu piroxicamiEudRS
1:2,5 chỉ có khoảng 50% hạt nhỏ hơn 1000 nm, hai mẫu piroxicam:EudRS 1:5 và piroxicamiEudRS 1:10 trên 75% hạt có kích thước hạt nhỏ hơn 1000 nm.
K T (m il)
1200
1000
PFRSIO
26 Mau
Hình 2.3 Biếu đồ so sánh kích thưóc hạt piroxicam và các hạt nano piroxicam:Eudragit RSIOO
(Px-DC và EuRS-DC lần lượt là mẫu chứng piroxicam và mẫu trắng Eudragit