-Các chất tổng hợp đƣợc, đƣợc khẳng định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR.
-Phổ hồng ngoại (IR): đƣợc ghi tại khoa Hóa, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1. Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỉ lệ 1: 200 rồi ép thành dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại hơi ẩm.
-Phổ khối lƣợng (MS): đƣợc đo bằng máy đo khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS của Viện Hóa học Việt Nam.
-Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR đƣợc ghi trên máy Bruker AV-500 tại trung tâm Khoa học và viện Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ dịch chuyển hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million-ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội
tetramethylsilan (TMS).
2.3.3. Thử tác dụng sinh học
2.3.3.1.Thử độc tính tế bào
-Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ (thử độc tính tế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng).
Các tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán thành hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104
đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 μl. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu đƣợc chuẩn bị trong 20 µl RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ml trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 μl mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối của DMSO không quá 0,1%.
Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/ml trong môi trƣờng đệm phosphat - PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc
cho 100 µl dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đo ở bƣớc sóng 510 nm.
-Tính kết quả
Giá trị nồng độ IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với mẫu trắng (mẫu trắng là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của bốn lần đo độc lập với giá trị độ hấp thu không lệch nhau quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism. Trong phƣơng pháp này giá trị IC50 ≤ 20 µg/μl đƣợc coi là
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá tính giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp
Trƣớc khi tiến hành thực nghiệm chúng tôi đánh giá độ giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp theo quy tắc Lipinsky.
Bảng 3.1: Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp
Kết quả cho thấy các chất dự kiến tổng hợp đều thỏa mãn 4 quy tắc trong bộ quy tắc do Lipinsky đƣa ra dùng đánh giá sơ bộ tính giống thuốc. Do đó chúng tôi tiến hành tổng hợp các chất đã dự kiến.
Chất Giá trị LogP ƣớc tính KLPT Số NH,OH Số N,O N H N NH NH O O OH 6 I 1,24 304 4 7 II N NH O O OH 6 1,70 290 2 5 III N NH O OH 5 2,94 262 2 4 IV N NH O OH 2,72 294 2 4
3.2. Hóa học
3.2.1. Tổng hợp hóa học
3.2.1.1.Tổng hợp N-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-N'-hydroxyoctandiamid (I)
Quy trình phản ứng tổng hợp chất I đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn theo sơ đồ sau: N H N NH2 N H N NH O O O CH3 N H N NH NH O O OH Acid monomethylsuberic, CDI, DMF I1 I2 I 6 6 50-60oC, 24h NH2OH.HCl, NaOH, methanol, H2O < 0oC, 2h Sơ đồ 1: Quy trình tổng hợp chất I a. Tổng hợp chất I2
Để tổng hợp chất I phải qua bƣớc trung gian là tổng hợp ester methyl 8-(1H-benzo[d]imidazol-2-ylamino)-8-oxooctanoat (I2). Chất I2 đƣợc tổng
hợp nhƣ sau:
Thực hiện phản ứng:
Cho 0,38 g (2 mmol) acid monomethyl suberic; 2 ml DMF; 0,32 g (2 mmol) CDI vào bình cầu 50 ml. Khuấy trong 10 phút để hoạt hóa.
Thêm 0,27 g (2 mmol) 2-aminobenzimidazol (I1).
Gia nhiệt phản ứng (to = 50-60oC) kết hợp khuấy từ trong 24 giờ.
Xử lý:
Đổ toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào khoảng 20 ml nƣớc lạnh, xuất hiện tủa, để lắng trong 10 phút.
Lọc tủa, rửa sạch bằng nƣớc cất.
Sấy khô tủa ở 60oC, thu đƣợc sản phẩm.
Kết quả:
Hiệu suất: 84% (0,51 g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi vàng.
Tonc: 152-154oC.
b. Tổng hợp chất I từ chất I2
Từ chất I2 cho phản ứng với hydroxylamin thu đƣợc sản phẩm là chất
N-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-N'-hydroxyoctandiamid (I).
Thực hiện phản ứng:
Lấy 0,30 g (1 mmol) methyl 8-(1H-benzo[d]imidazol-2-ylamino)-8- oxooctanoat (I2); 5 ml MeOH; 0,70 g (10 mmol) NH2OH.HCl cho vào bình phản ứng. Dùng siêu âm tạo hỗn dịch đồng nhất. Làm lạnh bình cầu bằng hỗn hợp nƣớc đá muối ăn, kết hợp khuấy từ.
Hòa tan 0,60 g (15 mmol) NaOH trong 1,5 ml nƣớc thu đƣợc dung dịch NaOH. Làm lạnh dung dịch này bằng hỗn hợp nƣớc đá muối ăn.
Đổ từ từ dung dịch NaOH lạnh vào bình cầu trên.
Giữ nhiệt độ bình phản ứng dƣới 0oC và khuấy, phản ứng khoảng 2 giờ. Chúng tôi theo dõi tiến trình phản ứng và xác định điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể nhƣ sau:
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng 1 giọt HCl 5% trên khay sứ, sau đó nhỏ một giọt dung dịch FeCl3 5%. Nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic đƣợc tạo thành.
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng trong vial bằng 1 giọt HCl 5%, kiểm tra TLC với pha động là DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1.
ban đầu.
Xử lý:
Hỗn hợp phản ứng đƣợc đổ vào khoảng 20 ml nƣớc đá trong cốc có mỏ, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 5, thu đƣợc tủa, để lắng trong vòng 10 phút.
Lọc tủa, rửa bằng nƣớc cất tới khi dịch lọc trung tính.
Sấy khô ở nhiệt độ 60oC, thu đƣợc sản phẩm.
Kết quả:
Hiệu suất: 69% (0,21 g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng.
Tonc: 176-178oC.
Dữ liệu phổ của chất I đƣợc trình bày ở các bảng 3.4, 3.5, 3.6.
3.2.1.2.Tổng hợp 8-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-N-hydroxy-8-oxooctanamid (II)
Quy trình phản ứng tổng hợp chất II đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn
theo sơ đồ sau:
N H N O O O CH3 II1 II2 II N NH O O OH 6 6 Acid monomethylsuberic, CDI, DMF 50-60oC, 24h NH2OH.HCl, NaOH, methanol, H2O < 0oC, 2h Sơ đồ 2: Quy trình tổng hợp chất II a. Tổng hợp chất II2
Chất ester methyl 8-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-8-oxooctanoat (II2) đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ I2 từ 0,24 g (2 mmol) indolin (II1).
Kết quả:
Hiệu suất: 78% (0,45 g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi vàng.
Tonc: 145-147oC.
b. Tổng hợp chất II từ chất II2
Chất 8-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-N-hydroxy-8-oxooctanamid (II) đƣợc tổng hợp từ 0,29 g (1 mmol) methyl 8-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-8- oxooctanoat (II2) với hydroxylamin tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất I.
Kết quả:
Hiệu suất: 62% (0,18 g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng.
Tonc: 171-173oC.
Dữ liệu phổ của chất II đƣợc trình bày ở các bảng 3.4, 3.5, 3.6, 3.7.
3.2.1.3.Tổng hợp chất 7-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (III)
Quy trình phản ứng tổng hợp chất III đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn
theo sơ đồ sau:
N H N O O CH3 III1 III2 III N NH O OH 5 5 NH2OH.HCl, NaOH, methanol, H2O < 0oC, 2h Ethyl 7-bromoheptanoat, K2CO3, KI, DMF
to phong thi nghiem, 24h
Sơ đồ 3: Quy trình tổng hợp chất III
Để tổng hợp chất III phải qua chất trung gian là tổng hợp ester ethyl 7-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)heptanoat (III2). Tổng hợp chất III2 nhƣ
sau:
Thực hiện phản ứng:
Hòa tan 0,24 g (2 mmol) indolin (III1) trong 2 ml DMF, thêm 0,55 g (4 mmol) K2CO3, khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
Thêm 0,09 g (0,5 mmol) KI vào bình phản ứng.
Hòa tan 0,47 g (2 mmol) ethyl 7-bromoheptanoat trong 1 ml DMF, nhỏ từ từ vào bình phản ứng.
Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 24 giờ.
Xử lý:
Đổ toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào khoảng 20 ml nƣớc lạnh, trung hòa bằng dung dịch HCl 5% về pH = 7, chiết sản phẩm 3 lần bằng dung môi DCM mỗi lần 5 ml, loại nƣớc bằng Na2SO4 khan.
Cất loại dung môi bằng máy cất chân không ở 35oC thu đƣợc sản phẩm ở dạng lỏng sền sệt màu vàng.
b. Tổng hợp chất III từ chất III2
Từ chất III2 cho phản ứng với hydroxylamin thu đƣợc sản phẩm là chất 7-(2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (III).
Thực hiện phản ứng:
Hòa tan toàn bộ sản phẩm thu đƣợc ở trên vào 10 ml MeOH trong bình cầu phản ứng, thêm tiếp 1,40 g (20 mmol) NH2OH.HCl. Làm lạnh bình cầu bằng hỗn hợp nƣớc đá muối ăn, kết hợp khuấy từ.
Hòa tan 1,20 mg (30 mmol) NaOH vào 3 ml nƣớc trong ống nghiệm. Làm lạnh dung dịch trên bằng hỗn hợp nƣớc đá muối ăn.
Đổ từ từ dung dịch NaOH ở ống nghiệm vào bình phản ứng.
giờ. Chúng tôi theo dõi tiến trình phản ứng và xác định điểm kết thúc bằng TLC, cụ thể nhƣ sau:
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng 1 giọt HCl 5% trên khay sứ, sau đó nhỏ một giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic đƣợc tạo ra.
- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng trong vial bằng 1 giọt HCl 5%, kiểm tra TLC với pha động là DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1.
- Kết thúc phản ứng khi kết quả TLC cho thấy đã phản ứng hết ester ban đầu.
Xử lý:
Hỗn hợp phản ứng đƣợc đổ vào khoảng 20 ml nƣớc đá trong cốc có mỏ, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 5, thu đƣợc tủa, để lắng trong 10 phút.
Lọc, rửa tủa bằng nƣớc cất tới khi dịch lọc trung tính.
Sấy khô ở nhiệt độ 60oC, thu đƣợc sản phẩm.
Kết quả:
Hiệu suất cả quá trình: 48% (0,25 g).
Cảm quan: chất rắn màu vàng cam.
Nhiệt độ nóng chảy: 132-134oC.
Dữ liệu phổ của chất III đƣợc trình bày ở bảng 3.4, 3.5.
3.2.1.4.Tổng hợp (2E)-3-[4-(2,3-dihydro-1H-indol-1-ylmethyl)phenyl]-N- hydroxyprop-2-enamid (IV)
Quy trình phản ứng tổng hợp chất IV đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn
N H N O O CH3 IV1 IV2 IV N NH O OH NH2OH.HCl, NaOH, methanol, H2O < 0oC, 2h K2CO3, KI, DMF, Methyl 3-(4-bromomethyl)cinamat
to phong thi nghiem, 24h
Sơ đồ 4: Quy trình tổng hợp chất IV
a. Tổng hợp ester IV2
Để tổng hợp chất IV phải qua chất trung gian là tổng hợp ester methyl (2E)-3-[4-(2,3-dihydro-1H-indol-1-ylmethyl)phenyl]prop-2-enoat (IV2). Tổng hợp chất IV2 nhƣ sau:
Thực hiện phản ứng:
Hòa tan 0,24 g (2 mmol) indolin (IV1) trong 2 ml DMF, thêm 0,55 g (4 mmol) K2CO3, kết hợp khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
Thêm 0,09 g (0,5 mmol) KI vào bình phản ứng.
Hòa tan 0,51 g (2 mmol) methyl 3-(4-(bromomethyl)cinnamat trong 1ml DMF, nhỏ từ từ vào bình phản ứng.
Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Xử lý:
Đổ toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào khoảng 20 ml nƣớc lạnh, trung hòa bằng dung dịch HCl 5% về pH = 7, xuất hiện tủa, để lắng trong 10 phút.
Lọc tủa, rửa sạch bằng nƣớc cất.
Sấy khô tủa ở 60oC, thu đƣợc sản phẩm.
Kết quả:
Cảm quan: chất rắn màu trắng.
Tonc: 135-137oC.
b. Tổng hợp chất IV từ chất IV2
Chất (2E)-3-[4-(2,3-dihydro-1H-indol-1-ylmethyl)phenyl]-N-hydroxyprop-2- enamid (IV) đƣợc tổng hợp từ 0,29 g (1 mmol) methyl (2E)-3-[4-(2,3-dihydro- 1H-indol-1-ylmethyl)phenyl]prop-2-enoat (IV2) tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất I.
Kết quả:
Hiệu suất: 65% (0,19 g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 147-148oC.
Dữ liệu phổ của chất IV đƣợc trình bày ở bảng 3.4, 3.5.
Sau đây là bảng tổng hợp một số đặc điểm của các acid hydroxamic tổng hợp đƣợc (bảng 3.2).
Bảng 3.2: Một số đặc điểm lý hóa và hiệu suất tạo hydroxamic từ ester của chất I-IV
Chất Công thức cấu tạo
Công thức phân tử Khối luợng phân tử Màu sắc Hiệu suất (%) I N H N NH NH O O OH 6 C15H20N4 O3 304 Trắng 69 II N NH O O OH 6 C16H22N2 O3 290 Trắng 62 III N NH O OH 5 C15H22N2 O2 262 Vàng cam 48 (cả quá trình) IV N NH O OH C18H18N2 O2 294 Trắng hơi vàng 65
3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Sắc kí lớp mỏng (TLC):
SKLM đƣợc tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, với 3 hệ dung môi khác nhau là DCM/MeOH (9/1), DCM/MeOH (5/1), DCM/MeOH/AcOH (90/10/1) quan sát dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm. Kết quả cho thấy các chất đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ với cả 3 hệ dung môi. Chỉ số Rf của các chất I-IV đƣợc trình bày trong bảng 3.3.
Đo nhiệt độ nóng chảy:
Các chất I-IV đƣợc tinh chế bằng cách kết tinh lại trong dung môi
methanol-nƣớc đều có dạng tinh thể rắn, đƣợc đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital). Kết quả cho thấy nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ nóng chảy 1-2oC). Nhƣ vậy có thể khẳng định các chất chúng tôi tổng hợp đƣợc là tinh khiết.
Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf trong pha động DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1 của các sản phẩm cuối I-IV đƣợc trình bày ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3: Giá trị nhiệt độ nóng chảy (tonc) và Rf với pha động
DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1 của các chất I-IV
Chất Công thức cấu tạo T0nc (0C) Rf
I N H N NH NH O O OH 6 176-178 0,32 II N NH O O OH 6 171-173 0,33 III N NH O OH 5 132-134 0,43
IV
N
NH
O
OH 147-148 0,40
Nhƣ vậy từ kết quả chạy sắc kí lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy của cả bốn chất, chúng tôi khẳng định các chất tổng hợp đƣợc là tinh khiết và tiến hành đo phổ IR, MS, 1
H-NMR, 13C-NMR.
3.2.3. Khẳng định cấu trúc
Để khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc, chúng tôi tiến hành ghi phổ khối lƣợng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H, phổ cổng hƣởng từ hạt nhân 13C của các chất sản phẩm. Kết quả ghi phổ cụ thể đƣợc trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục.
a. Khối phổ (MS)
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất I-IV
Chất Công thức cấu tạo m/z
I (M=304) N H N NH NH O O OH 6 303,0 [M-H]─ II (M=290) N NH O O OH 6 289,0 [M-H]─ III (M=262) N NH O OH 5 262,9 [M+H]+ 244,9 [M-OH]+ IV (M=294) N NH O OH 296,1 [M+2H]+
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-4) chúng tôi đều thấy có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự
kiến, các pic kết hợp đều có cƣờng độ nhỏ. Vì vậy có thể khẳng định phổ đồ là phù hợp với công thức của bốn chất dự kiến.
b.Phổ hồng ngoại (IR)
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất I-IV
Chất Công thức cấu tạo
Số sóng (cm-1) tƣơng ứng với giao