2.3.1. Phƣơng pháp b o chế viên nén
Bào chế viên n n GPKD indapamid theo phương pháp xát hạt ướt, gồm các bước (quy trình cụ thể được trình bày ở phụ lục 1):
- Rây các nguyên liệu: các loại HPMC trong công thức, DCP, lactose qua rây 180, rây Aerosil và magnesi stearat qua rây 125.
- Cân các thành phần theo công thức.
- Trộn bột kép (trừ tá dược dính, trơn, Poloxamer, dược chất).
- Nhào ẩm khối bột kép với dung dịch dược chất, PVP, Poloxamer trong ethanol 96%.
- Xát hạt qua rây 1000, sấy ở 50-600C sau 60 phút sửa hạt qua rây 1000. Tiếp tục sấy ở nhiệt độ trên cho tới khi đạt hàm ẩm từ 2-5% (khoảng 30-45 phút)
- Cân xác định lại khối lượng cốm và trộn tá dược trơn.
- Dập viên với khối lượng trung bình 200 mg với chày Φ8 bằng máy dập viên tâm sai, với lực dập đảm bảo cho viên có độ cứng 45-60N.
Ghi chú: quy mô phòng thí nghiệm: 100 viên/mẻ, riêng công thức tối ưu: 500 viên/mẻ
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá tiêu chuẩn chất lƣợng viên nén 2.3.2.1. Một số chỉ tiêu chất lƣợng
- Hình thức: viên có hình trụ lồi, màu trắng hoặc trắng ngà, cứng, chắc; bề mặt bóng đẹp, không bị bong mặt, sứt cạnh.
- Độ cứng: xác định bằng máy đo độ cứng ERWEKA, thử với 10 viên, lấy giá trị trung bình.
- Độ mài mòn: xác định bằng máy đo độ mài mòn ERWEKA. Yêu cầu độ mài mòn không được vượt quá 1%.
- Độ đồng đều khối lượng: cân khối lượng c a 20 viên bất kỳ rồi tính giá trị trung bình, yêu cầu độ chênh lệch không quá ±7,5%.
- Một số chỉ tiêu bán thành phẩm:
+ Đánh giá độ ẩ c a hối bột xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô trên cân hàm ẩm Precisa XM 60, thử với khối lượng bột trên 1 g.
+ Đánh giá độ trơn chảy c a hối bột
Phương pháp 1: cho hạt chảy qua phễu Duran có đường kính 10 mm, tính khối lượng bột chảy qua trong một giây (g/s).
Phương pháp 2: tính chỉ số Carr: dùng máy gõ xác định tỷ trọng ERWEK tính để tính tỷ trọng biểu kiến dbk c a khối bột ban đầu có tỷ trọng thô dthô và tính theo công thức:
chỉ số Carr = (dbk - dthô).100/dbk [1], 5.
Bảng 2.3. Tương quan giữa chỉ số Carr và tính chất trơn chảy c a hạt/bột [1] Chỉ số Carr Phân loại độ trơn chảy
5 – 15 Rất tốt 12 – 16 Tốt 18 – 21 Dễ chảy (trung bình) 23 – 35 Kém 33 – 38 Rất kém > 40 Vô cùng kém
2.3.2.2. Phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong viên nén
Phương ph p đo quang vi sai theo bước sóng:
- Pha dung dịch thử: cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên. Nghiền thành bột mịn, cân chính xác 1 lượng bột viên tương ứng với khoảng 1,5 mg indapamid cho vào bình định mức 25 ml. Thêm vào khoảng 20 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút/lần x 3 lần. Bổ sung ethanol 96% vừa đ , để yên khoảng 16 giờ, siêu âm 15 phút rồi ly tâm 4000 vòng/phút x 10 phút, lọc dịch trong phía trên qua màng 0,45 µm. Hút chính xác 5,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung đệm pH 6,8 cho vừa đ , lắc đều được dung dịch thử (nồng độ Cthử khoảng 6 µg/ml).
- Pha dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 15,0 mg indapamid chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 7 ml ethanol 96%, siêu âm cho tan hết, bổ sung ethanol 96% vừa đ , lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch thu được pha loãng bằng ethanol 96% vừa đ 25 ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch đã pha loãng cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung đệm phosphat pH 6,8 vừa đ , lắc đều được dung dịch chuẩn (nồng độ Cchuẩn chính xác khoảng 6 µg/ml).
- Mẫu trắng: đệm phosphat pH 6,8.
- Đo quang 2 mẫu tại 2 bước sóng 240 nm và 275 nm và tính kết quả theo công thức ở phụ lục 4.
Phương ph p HPLC:
- Pha động: dung dịch A: methanol (30:70)
- Dung dịch : Hút chính xác 0,4 ml dung dịch HClO4 đặc vào bình định mức 1 lít, bổ sung nước cất 2 lần vừa đ .
- ung dịch chuẩn (9 µg/ml): cân chính xác 18,0 mg indapamid chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm 70 ml pha động, siêu âm 5 phút cho tan hoàn toàn, bổ sung pha động cho đến thể tích vừa đ 100 ml và lắc đều. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch đó chuyển vào bình định mức 100 ml, bổ sung pha động vừa đ .
- ung dịch thử: nghiền, đồng nhất hóa viên (khoảng 20 viên), phân tán một lượng bột tương đương 18,0 mg indapamid bằng 70 ml pha động trong bình định mức 100 ml, siêu âm 20 phút, thêm pha động vừa đ tới vạch 100 ml, để yên khoảng 16 giờ. Ly tâm một phần dung dịch với tốc độ 4000 vòng/phút x 10 phút. Chuyển 5,0 ml phần dịch trong vào bình định mức 100 ml, bổ sung pha động vừa đ . Dung dịch thử thu được có nồng độ khoảng 9,0 µg/ml.
- th ng ắc :
+ Detector: UV 254 nm.
+ Cột: C18, Phenomenex (25 cm x 4,6 mm, 5 µm). Tốc độ dòng : 0,8 ml/min.
Thể tích tiêm: 20 µl.
2.3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá giải phóng dƣợc chất từ viên nén Điều kiện:
- Thiết bị sử dụng: cánh khuấy.
- Môi trường: 500 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8. - Nhiệt độ: 37±0,5 oC.
- Tốc độ khuấy: 100±1 vòng /phút.
- Thời điểm lấy mẫu: 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 14 giờ, 16 giờ.
Tiến hành:
- Bước 1: pha đệm phosphat pH 6,8
- Bước 2: chuẩn bị các dung dịch chuẩn (cách pha được trình bày ở phụ lục 2): + Dung dịch chuẩn gốc C0 nồng độ 1000µg/ml trong ethanol 96%.
+ Dung dịch chuẩn C2 nồng độ 2 μg/ml trong đệm phosphat pH 6,8.
+ Dung dịch chuẩn thêm C30 nồng độ 30 μg/ml trong đệm phosphat pH 6,8. - Bước 3: chuẩn bị các dung dịch thử:
Tại các thời điểm lấy mẫu, hút chính xác 12,0 ml dịch hòa tan. Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút x 10 phút. Dịch ly tâm phía trên được lọc qua màng 0,45 µm. Hút chính xác 1,0 ml pdung dịch chuẩn thêm C30 vào bình định mức 10 ml. Bổ sung bằng dịch thử hòa tan sau lọc cho vừa đ thể tích thu được dung dịch thử. Bổ sung 12 ml môi trường hòa tan vào cốc và tiếp tục thử.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn đo: hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn thêm C30 vào bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đ bằng dung dịch chuẩn C2 2 μg/ml.
Đo độ hấp thụ UV c a dung dịch thử và dung dịch chuẩn đo ở bước sóng 240 nm và 275 nm. Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 6,8.
% indapamid giải phóng tại các thời điểm tính theo công thức ở phụ lục 5.
2.3.2.4. Phƣơng pháp đánh giá động học giải phóng dƣợc chất từ viên nén
Từ kết quả thử hòa tan thu được, động học giải phóng c a viên được đánh giá bằng mô hình động học bậc 0 hoặc mô hình Higuchi đã được trình bày ở mục 1.1.5, dùng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa % indapamid giải phóng với thời gian (với mô hình bậc 0) hay căn bậc hai thời gian
(với mô hình Higuchi), xác định hệ số tương quan R2 và đánh giá độ tin cậy c a mô hình với phương pháp nghiên cứu, dự đoán bản chất quá trình hòa tan từ viên.
2.3.2.5. Phƣơng pháp đánh giá sự tƣơng quan giữa đồ thị giải phóng viên thực nghiệm với viên đối chiếu
Dựa vào hệ số tương đồng f2 theo quy định c a FD (thể hiện sự giống nhau c a hai đường cong hòa tan) khi so sánh giữa đồ thị hòa tan c a viên n n indapamid bào chế được và đồ thị hòa tan c a viên đối chiếu. Giá trị f2 được tính theo CT:
( ) 100 1 1 lg . 50 5 , 0 1 2 2 n t t t T R n f
Trong đó: n là số điểm lấy mẫu thử; Rt, Tt lần lượt là % dược chất giải phóng tại thời điểm t c a mẫu đối chiếu, mẫu thử.
Ý nghĩa: f2 nhận giá trị từ 0-100. Hai đồ thị hòa tan được coi là giống nhau khi f2 ≥ 50 (f2 càng lớn, hai đồ thị càng giống nhau) [15].
2.3.3. Phƣơng pháp thiết kế thí nghiệm và tối ƣu hóa công thức
- Sàng lọc ban đầu xác định biến đầu vào ảnh hưởng đến biến đầu ra.
- Thiết kế thí nghiệm dựa vào biến đầu vào và biến đầu ra, sử dụng phần mềm Modde 8.0 và tiến hành thí nghiệm. Từ kết quả thu được xây dựng mối quan hệ giữa các biến đầu ra và biến đầu vào, mối quan hệ này có thể biểu diễn dưới dạng phương trình hồi quy dạng đa thức bậc 2 bằng phần mềm Modde 8.0.
- Tối ưu hóa các biến đầu ra: đọc kết quả thông qua việc phân tích bảng Anova: mức ý nghĩa phồi quy, pkhuyết, R2, R2adj. Đánh giá mức ý nghĩa c a hệ số hồi quy, phân tích mặt đáp.
- Làm thí nghiệm theo giá trị tối ưu c a các biến đầu vào vừa tìm được để kiểm chứng lại các chỉ tiêu [7].
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát lại một số tiêu chí trong phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng viên indapamid giải phóng kéo dài indapamid giải phóng kéo dài
3.1.1. Phƣơng pháp đo độ hấp thụ UV vi sai bƣớc sóng
Quét phổ tìm bước sóng hấp thụ cực đại:
Tiến hành qu t phổ UV-VIS dung dịch indapamid có nồng độ C = 6 μg/ml trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 từ bước sóng 200 nm đến 400 nm xác định được bước sóng hấp thụ cực đại là λmax = 239,4 nm. Từ kết quả trên và qua các tài liệu tham khảo [8], [9], [25], chọn 2 bước sóng 240 nm và 275 nm để tiến hành đo quang vi sai. Hình ảnh phổ được trình bày ở phụ lục 6.
Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu mật độ quang với
nồng độ dung dịch indapamid trong môi trường đệm phosphat pH 6,8:
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 μg/ml được thêm chuẩn giống dịch thử hòa tan viên n n ở phương pháp 2.3.2.3. Kết quả thu được thể hiện trong bảng và hình sau:
Bảng 3.1. Hiệu mật độ quang (ΔD) c a các dung dịch sau khi thêm chuẩn C thử (µg/ml) 0,5 1 2 3 4 5 6
C sau thêm
chuẩn (µg/ml) 3,45 3,9 4,8 5,7 6,6 7,5 8,4 ΔD 0,194 0,219 0,264 0,313 0,354 0,415 0,458
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hiệu mật độ quang với nồng độ indapamid trong dung dịch đệm pH 6,8
y = 0,0534x + 0,0087 R² = 0,9984 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 2 4 6 8 10 C (µg/ml)
Nhận xét: đường chuẩn thu được có R2 = 0,9984 (~ 1) cho thấy sự phụ thuộc c a hiệu mật độ quang với nồng độ dung dịch indapamid trong môi trường đệm pH 6,8 ở bước sóng khảo sát 240 nm và 275 nm là tuyến tính trong khoảng 3,5-8,4 µg/ml. Vì vậy, có thể sử dụng phương pháp thêm chuẩn để định lượng dung dịch indapamid có nồng độ từ 0,5-6 µg/ml.
3.1.2. Phƣơng pháp HPLC
- Tính thích hợp
Pha mẫu dung dịch chuẩn indapamid nồng độ 9,0 µg/, tiêm 6 lần, xác định diện tích pic và thời gian lưu. Kết quả được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Diện tích pic và thời gian lưu c a các mẫu xác định tính thích hợp
Mẫu 1 2 3 4 5 6 TB RSD%
TR
(phút) 4,746 4,757 4,820 4,816 4,778 4,784 4,784 Spic
(mAU) 453601 452016 452786 454696 452885 454627 453435 0,237
Nhận xét: tại nồng độ 9,0 µg/ml, phương pháp HPLC cho độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Phương pháp đạt yêu cầu về tính thích hợp.
- Độ đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu trắng (pha động), mẫu placebo (hỗn hợp tá dược thành phần giống công thức viên), mẫu chuẩn (chỉ có dược chất, không có tá dược) và mẫu thử (có dược chất và hỗn hợp tá dược thành phần giống công thức viên) có nồng độ ≈ 9 µg/ml. Tiêm lần lượt các mẫu. Kết quả được trình bày như bảng và hình sau:
1Bảng 3.3. Diện tích pic và thời gian lưu c a các mẫu xác định độ đặc hiệu Mẫu Thời gian lưu ( phút) Diện tích pic (mAU)
Mẫu trắng - -
Mẫu placebo - -
Mẫu chuẩn 4,842 456972
Mẫu thử 4,849 454811
Nhận xét: không thấy xuất hiện pic indapamid trên sắc ký đồ c a mẫu trắng và mẫu placebo. Mẫu thử và mẫu chuẩn có thời gian lưu và diện tích pic tương đối giống nhau. Phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu.
- Độ tuyến tính
Tiến hành pha dãy dung dịch indapamid có nồng độ 6,3; 7,2; 8,1; 9,0; 9,9; 10,8 µg/ml. Tiêm lần lượt các mẫu. Xác định thời gian lưu và diện tích pic. Kết quả thu được trong bảng và hình dưới đây:
Bảng 3.4. Diện tích pic và thời gian lưu c a các mẫu xác định khoảng tuyến tính C (µg/ml) 6,3 7,2 8,1 9,0 9,9 10,8 TR (phút) 4,815 4,817 4,758 4,757 4,760 4,741 Spic (mAU) 308823 352910 404487 452150 495947 546462
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ dung dịch indapamid
Nhận xét: hệ số tương quan R2 = 0,9996 (~ 1) cho thấy diện tích pic và nồng độ dung dịch indapamid tuyến tính trong khoảng 6,3-10,8 µg/ml. Vì vậy, đảm bảo được tính chính xác khi định lượng indapamid có trong nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm tại nồng độ 9,0 µg/ml bằng phương pháp HPLC.
- Độ đúng
Tiến hành pha các dung dịch indapamid ở nồng độ 7,2; 9,0; 10,8 µg/ml (tương ứng với 80%, 100% và 120% c a nồng độ 9 µg/ml) với sự có mặt c a hỗn
y = 52856x - 25124 R² = 0,9996 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 0 2 4 6 8 10 12 Spic (m AU)
hợp tá dược thành phần giống công thức viên. Mỗi nồng độ pha 3 mẫu. Tiêm lần lượt các mẫu. Xác định thời gian lưu và diện tích pic. Kết quả thu được trong bảng và hình dưới đây:
Bảng 3.5. Độ đúng c a phương pháp HPLC dùng trong định lượng indapamid Nồng độ Lần đo Clý thuyết (µg/ml) Ctìm thấy (µg/ml) Độ đúng (%) C = 7,2 µg/mL 1 7,20 7,16 99,44 TB = 99,31 RSD = 0,63% 2 7,28 7,18 98,63 3 7,16 7,15 99,86 C = 9,0 µg/mL 1 9,00 9,04 100,44 TB = 100,33 RSD = 0,61% 2 9,10 9,07 99,67 3 8,95 9,03 100,89 C = 10,8 µg/mL 1 10,80 10,83 100,28 TB = 100,22 RSD = 0,46% 2 10,91 10,88 99,73 3 10,74 10,81 100,65
Nhận xét: kết quả cho thấy, ở tất cả các nồng độ khảo sát đều có tỷ lệ tìm lại cao (98,63 -100,89%) và có giá trị RSD < 2%. Vì vậy, định lượng indapamid nồng độ 9,0 µg/ml bằng phương pháp HPLC cho độ đúng tốt.
- Độ chính xác
Pha 6 mẫu thử indapmid ở nồng độ 9 µg/ml với sự có mặt c a hỗn hợp tá dược thành phần giống công thức viên. Tiêm lần lượt các mẫu. Kết quả được được ghi trong bảng sau:
Bảng 3.6. Diện tích pic và thời gian lưu c a các mẫu xác định độ chính xác
Mẫu 1 2 3 4 5 6 TB RSD%
TR
(phút) 4,825 4,786 4,752 4,843 4,810 4,794 4,802 Spic
(mAU) 453810 454315 454510 456935 454334 455259 454861 0,246
Như vậy qua đánh giá một số tiêu chí cho thấy phương pháp HPLC với các điều kiện như trên có thể định lượng tương đối chính xác hàm lượng indapamid trong nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm.
3.2. Khảo sát độ hòa tan từ viên đối chiếu Natrilix 1,5mg SR
Đ nh gi độ hòa tan của viên đối chiếu: theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.2.3, thu được kết quả thử hòa tan như sau:
Bảng 3.7. % GPDC tại các thời điểm c a viên đối chiếu (n = 6, ̅ (%), SD) 2h 4h 6h 8h 14h 16h ̅(%) 10,54 21,95 33,73 44,35 80,44 85,63
SD 0,96 1,47 2,10 2,92 3,73 3,58
Đ nh gi động học giải phóng của indapamid từ viên đối chiếu: theo phương pháp nêu ở mục 2.3.2.4, kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.8. Phương trình động học viên đối chiếu Loại động học Phương trình hồi quy R2
Bậc 0 y = 4,9113x + 3,2648 0,9956 Higuchi y = 22,849x – 14,122 0,9077