2.2.2.1. Khuếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR ● Tách chiết DNA khuôn mẫu từ chủng ETEC
- Lấy dịch khuẩn đó nuụi qua đêm cho vào ống falcol 5ml, ly tâm 3000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 200μl dung dịch Sol I (resuspension solusion), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (lysis buffer), đảo nhẹ.
- Thêm 350μl dung dịch Sol III (neutralization), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút. - Ly tâm 14000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Cho 500àl preperation solution vào cột miniprep colunm - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu kết tủa.
- Cho phần dịch nổi trên vào cột miniprep vừa ly tâm - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu kết tủa
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl-700àl optinal Wash Solution, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.
- Làm khô DNA bằng máy , sau đú thêm 100μl nước khử ion,
để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
● Thực hiện phản ứng PCR:
- Sau khi đo nồng độ DNA khuụn , tớnh và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn được giống nhau và đạt khoảng 200ng/ml
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy. Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng
Dung dịch đệm (10X) dNTPs
Primer BamHI- F Primer XhoI- R
Taq DNA polymerase
DNA plasmid được tách từ vi khuẩn Nước khử ion vô trùng
Chu trình nhiệt 950 C : 5 phút 940C : 30 giây 640C : 30 giây 30 chu kỳ 720C : 1 phút 720C : 3 phút
● Chạy điện di và tinh sạch đoạn gen EltB
- Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong 30 phút ở hiệu điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide. Chụp ảnh để ghi lại kết quả điện di bằng hệ thống máy Genedoc, BioRad.
- Tinh sách sản phẩm PCR bằng kít tinh sạch DNA cảu (QIAGEN)
2.2.2.2. Nuôi cấy và tinh sạch Plasmid pGEX
- Chủng E. Coli DH5α có chứa plasmid pGEX được nuôi cấy qua đêm trên môi trường canh thang LB có chứa 100àg ampicillin/lit
- Lấy 1 huyền dịch khuẩn đó nuụi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 100μl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/ thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
- Thêm 150μl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl (24:1) theo tỷ lệ 1:1.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5ml mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô DNA bằng máy , sau đó thêm 50μl nước khử ion,để ở nhiệt
độ phòng cho tan hoàn toàn.
- Kiểm tra độ tinh sạch Plasmid bằng cách điện trên thach điện - Bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.3. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX
Đoạn gen EltB mã hóa tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiờt của ETEC sẽ được biến nạp vào vector biểu hiện pGEX. Protein EltB sẽ được tổng hợp trong tế bào E. Coli BL21 dưới sự điều khiển của Tac promoter (hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ biến nạp EltB vào vector biểu hiện pGEX
Đoạn gen EltB và plasmid pGEX sau khi được tinh sạch sẽ được cắt bằng Enzyme giới hạn XhoI và BamH1 theo tỷ lệ
Thành phần Thể tích (àl) BamH1 1 Xho1 1 Buffer 1 DNA 2 H20 5 Tổng số 10 Ủ ở 370C trong 5 giờ
Điện di kiểm tra sản phẩm cắt
Tinh sạch sản phẩm cắt: sử dụng kít tinh sạch của QIAGEN
2.2.2.3.2. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX
Sau khi cắt bằng Enzyme giới hạn đoạn gen EltB sẽ được nối vào vector pGEX bằng ligation kit (promega) theo qui trình sau
Thành phần Thể tớch(àl) Ligate bufer 10X 2 EltB DNA 5 pGEX plasmid 2 Ligate 1 H20 10 Tổng số 20
Ủ ở nhiệt độ 160C trong 16-18 giờ
Biến nạp sản phẩm ligate vao tế bào biến nạp E. Coli DH5α theo các bước như sau:
Trộn hỗn hợp ligate với 100àl tế bào biến nạp E. Coli DH5α, ử trong đá mạt 30 phút
Ủ hỗn hợp ở 42oC trong 2 phút
Cho hỗn hợp trở lại đá mạt trong 2 phút Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng 2 phút
Nhỏ vào hỗn hơp 1ml môi trường canh thang SOC, ủ 30 phút ở 370C Ly tâm 2500v/5 phút ở 40C
Lấy 100àl cặn lỏng lờn môi trường thạch LB có chứa 100àl/l ampicillin ủ ở 370C qua đêm.
Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR
2.2.2.3.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colonies
Nguyên lý:
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA được thay thế bằng DNA plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94o C đến 95o C, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.
Tiến hành:
Hòa tan tế bào vi khuẩn trong nước khử ion. Sau đó sử dụng hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR.
+ Kỹ thuật cắt Enzyme giới hạn:
Những plasmid tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng phản ứng PCR cho kết quả dương tính tiếp tục được kiểm tra bằng enzym giới hạn. Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp này được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, có bổ sung Ampicilin. Sau đó, DNA của những plasmid tái tổ hợp được tách chiết theo quy trình và được xử lý với các enzym giới hạn.
Thành phần phản ứng cắt plasmid mang đoạn EltB với enzym BamHI và XhoI như sau:
Thành phần Thể tích (µl)
Nước cất 2× 5,0
Enzym BamHI 1,0
Enzym XhoI 1,0
DNA plasmid -EltB 2,0
Tổng 10,0
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 5 giờ, sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
+ Giải trình tự gen:
- Cách pha hỗn hợp phản ứng cho bigdye -PCR:
Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl) Sản phẩm PCR tinh sạch 1.5àl Mồi 2.0 àl Bigdye 2.5X 3.0 àl Buffer 5X 4.0 àl Nước siêu sạch 9.5 àl Tổng số: 20 àl
- Chương trình nhiệt cho bygdye-PCR
1 960C : 1 phút 960C : 30giây
2 500C : 30 giây 30 chu kỳ 600C : 4 phút
- Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI (Applied Biosystem) - So sỏnh các đoạn gen và được so sánh với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen
2.2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB
- Tinh sạch plasmid pGEX-EltB
Chủng vi khuẩn E. Coli DH5α có chứa Plasmid pGEX-EltB được nuôi cấy qua đêm trong môi trường canh thang LB có chứa 100àg ampicillin sau đó được ly tâm lấy căn tế bào và tách chiết plasmid (như ở bước 2.2.2.2)
- Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế bào biểu hiện protein E.coli BL21
Lấy 1àl plasmid pGEX-EltB cho vào 100àl tế bào biến nạp E. Coli BL21
Ủ trong hỗn hợp trong đá 30 phút
Cho hỗn hợp vào trong máy ủ nhiệt ở 420C Để trở lại trong đá 1 phút
Cho ra nhiệt độ phòng 1 phút
Nhỏ vào hỗn hơp 1ml môi trường canh thang SOC, ủ 30 phút ở 370C Ly tâm 2500v/5 phút ở 40C
Lấy 100àl cặn lỏng lờn môi trường thạch LB có chứa 100àl/l ampicillin ủ ở 370C qua đêm.
Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR
- Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB
Nuôi cấy chủng vi khuẩn E. Coli BL21-pGEX-EltB trong 50ml môi trường canh thang LB-ampicillin ở 370C trong 5-6 giờ (nồng độ OD = 0,5-0,7)
Nhỏ hoạt chất kích thích sinh protein ITPG (nồng độ cuối cùng trong huyền dịch đạt 1 mM/l) ủ 370C trong 5-6 giờ
Ly tâm 6000v/15 phút bỏ dịch nổi lấy cặn tế bào tách chiết protein Hòa cặn tế bào vi khuẫn vào trong 3ml dung dịch PBS 1x
Nhỏ 80àl dung dịch Lysozyme nồng độ 10mg/ml, ủ ở 220C trong 10 phút Nhỏ 30àl dung dich triton X-100
Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm máy Braun sonicator Ly tâm 10.000 vòng/ 15 phút thu dịch nổi
Trộn dịch với 2ml glutathion-sepharose gel
Ủ hỗn hợp ở 40Ctrong 18 giờ sau đó chuyển hỗn hợp sang cột tinh sạch protein
Rửa cột bằng 20ml PBS có chứa 0,1% Triton X-100
Thu hoạch 1ml trong một lần sau đó phân tích protein tái tố hợp EltB bằng điện di trên gel Agarose 1,5% và nhuộm gel bằng Ethidium bromide
2.2.2.5 Kiểm tra protein EltB bằng Western blot
Western blot là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.
- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.
- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-khỏng thể đối với protein quan tâm.
- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.
- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein- khỏng thể sơ cấp-khỏng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.
- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thiết kế và biểu hiện thành công protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên quy mô phòng thí nghiệm
2. Sản xuất kháng thể kháng protein tái tổ hơp EltB trên quy mô phòng thí nghiệm
CHƯƠNG 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN
- Bàn luận dựa vào kết quả thu được
DỰ TRÙ KINH PHÍ
Kinh phí trích từ đề tài. “Nghiên cứu quy trình sản xuất bộ sinh phẩm
immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của E.coli sinh độc tố ở trên một số nhóm thực phẩm” Đề tài được tài trợ kinh phí từ ngân sách
KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH VÀ NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
- Đề tài được tiến hành từ tháng 2 năm 2011 đến tháng 10 năm 2011. - Địa điểm nghiên cứu: Labo Trung tâm và bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội
I. TIẾNG VIỆT
1. Alf.A.Lindberg, (1998). Những tiến bộ mới trong miễn dịch dự
phòng các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột. Hội thảo các bệnh nhiễm
khuẩn đường ruột và đường thở- Hà Nội 18-21/3/1998: pp. 60-64 2. Đặng Oanh(2002). Tình hình hoạt động mục tiêu đảm bảo chất
lượng vệ sinh an toàn thực phẩm 9 tháng đầu năm 2001, Tạp chí Y
học dự phòng Tõy Nguyờn, số 20, tr 17-19.
3. Đinh Thị Bích Hằng.(2002). Tìm hiểu tình trạng ô nhiễm vi khuẩn
của một số loại thức ăn đường phố tại phường Thắng Lợi,thành phố Buôn Ma Thuột. Luận văn thạc sĩ, trường đại học y Hà Nội
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998).Phương pháp PCR. Sinh học phân
tử, Nhà xuất bản giáo dục, tr 190- 199
5. Hoàng Tiến Mỹ(1997), “Khảo sát các vi khuẩn thường gây tiêu chảy
cấp ở mọi lứa tuổi và tớnh khỏng thuốc”, Luận án tiến sỹ y khoa,
Trường Đại học y dược TP. Hồ Chí Minh.
6. Huỳnh Tân Tiến, (2000), Thực trạng thức ăn đường phố tại thành
phố Hồ Chí Minh, Tài liệu hội thảo bảo đảm vệ snh an toàn thức ăn đường phố với văn minh đô thị, Hà Nội, Tr. 37-40
7. Khuất Hữu Thanh,( 2003). Cơ sở di truyền học phân tử và kỹ thuật
gen. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội
8. Kiều Thị Mai Phương. (1998), Khảo sát thực trạng ô nhiễm vi
khuẩn của thức ăn đường phố trong các cửa hàng ăn dọc quốc lộ 1A huyện Tiên Sơn, tỉnh Bắc Ninh, Luận án thạc sỹ, Trường Đại học Y tế
Luận văn thạc sĩ y học Trường Đại học Y Hà Nội
10. Nguyễn Thị Hiền và cs (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn và nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn
11. Nguuyễn Thị Thu Thái.( 2006). Xác định gen aap, agg R,astA, của
EAEC và một số chủng E.coli khác bằng kỹ thuật PCR . Luận văn
thạc sĩ, trường đại học y Hà Nội
12. Nguyễn Thị Sợi (1996), Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm về chỉ
tiêu vi sinh của thức ăn đường phố và hộ gia đình tại Hải Phòng,
Luận án thạc sỹ, Trường Đại học Y Hà Nội, Tr. 54-72
13. Nguyễn Hữu Dòng (2005), Hội nhập kinh tế quốc tế và vấn đề đổi
mới công tác quản lý thực phẩm ở Việt Nam. Cục An toàn vệ sinh
thực phẩm - www.vfa.gov.vn.
14. Phạm Hồng Nhung (2000), “Đánh giá độ nhậy và độ đặc hiệu của
phản ứng PRC trong chẩn đoán Eschierichia coli sinh độc tố ruột(ETEC), Luận văn tốt nghiệp bác sỹ, Trường Đại học y Hà Nội.
15. Phạm Nguyệt Minh (2010) Nghiên cứu xây dựng quy trình phát
hiện gen độc tố của B.cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex PCR . Luận văn thạc sĩ y học trường đại học y Hà Nội
16. Phạm Văn Tất (1999) “Ngộ độc thực phẩm trong 2 năm qua”. Thuốc
và sức khỏe số 132, Tr.10.
17. Phùng Khắc Cam (1995), “Bệnh tiêu chảy do Escherichia coli”, Sổ
nghiên cứu khoa học và Phát triển Công nghệ cấp Nhà nước.
19. Trần Trí Tuệ (2002). Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật
PCR đa mồi trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy. Luận văn
thạc sỹ y học, trường đại học y Hà Nội.
20. Trần Văn Thọ và cs (2004), Đánh giá thực trạng và đề xuất một số
giải pháp quản lý chủ yếu bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm ở Hải Phòng. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn.
II PHẦN TIẾNG ANH
21. August.1. Bonrgeois, Chris H. Gardiner (1993), “Etiology of acute
diarrhea among United States militery personel deployed to South America and west africa”, J.Trop.Med.Hyg, Vol 48(2), p. 243-248.
22. Bean, N.H., Griphin, P.M., Goulding, J.S. and Ivey, C.B. (1990).
Foodborne disease outbreaks, 5 year summary, 1983-1987. J. Food
Prot. 53: 711-728.
23. Bitzan M et al. (1998) “ The rol of E.coli O157 infections in the
classical haemolytic uraemic syndrome: results of a Central European, multicentre study”, Epidemiology and infection deseases
(110), pp. 183- 196.
24. Black, R. E., K. H. Brown, S. Becker, A. R. M. Abdul Alim, and M. H. Merson. 1982. Contamination of weaning foods and
transmission of enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea in children in rural Bangladesh. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 76:259–264. 25. Black, R. E., M. H. Merson, B. Rowe, P. R. Taylor, A. R. M.