Do những nguyên nhân đã trình bày ở trên kết hợp với những hạn chế về thời gian và kinh phí dẫn đến việc không thể có α – Cbtx tinh sạch để trực tiếp phân tích tương tác giữa α – Cbtx và peptide đã thiết kế nên chúng tôi quyết định tiến hành thêm một thí nghiệm kiểm tra khả năng của peptide trong việc hạn chế tác dụng gây độc của nọc rắn toàn phần bằng cách trộn peptide với nọc rắn với liều lượng và thời gian ủ xác định sau đó tiêm cho chuột thí nghiệm. Kết quả được trình bày trên bảng 7.
Bảng 7. Tác động của hỗn dịch peptide và α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm.
Lô Liều nọc rắn
Liều peptide
(mg/kgP/lần) Thời điểm tiêm
Tỉ lệ chuột chết sau 72 giờ
Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ 1 0,8 mg/kgP 0 Trộn α-cobratoxin với nước cất để 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 2 giờ
2 25
Trộn peptide và α-cobratoxin ủ 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 3 giờ
3 50
Trộn peptide và α-cobratoxin ủ 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 4 giờ
46
Từ những kết quả thu được ở trên, ta có thể đi đến kết luận peptide đã được thiết kế không có khả năng kháng nọc độc tổng số của rắn hổ mang đất N. kaouthia. Vì mục tiêu thiết kế polypeptide này là để thu được chuỗi polypeptide mô hình có khả năng gắn ái lực cao với độc tố nọc rắn α – Cbtx nên cần có một phân tích trực tiếp để kiểm tra tương tác của peptide thiết kế với độc tố thần kinh α – Cbtx. Đó là bước đầu tiên duy nhất để đánh giá chất lượng của chuỗi polypeptide đã được mô phỏng.
Mặc dù vậy, việc nghiên cứu ứng dụng và làm chủ phần mềm Discovery studio giúp phát triển những hướng nghiên cứu mới trong khoa học cơ bản cũng như trong chiến lược phát triển các loại dược phẩm mới. Phần mềm này thực sự là một công cụ hỗ trợ hữu ích cho các nhà khoa học trong nghiên cứu.
47
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
1. Đã thiết kế thành công mô hình polypeptide có khả năng gắn với độc tố α – Cbtx từ nọc rắn hổ mang N. kaouthia trên cơ sở trình tự của thụ thể α7-AChR của
người bằng phần mềm Discovery Studio 2.5.
2. Mô hình tương tác giữa peptide với độc tố α – Cbtx đã được mô phỏng thành công bằng chương trình “Dock Protein (Zdock).
3. Từ kết quả mô phỏng, đã tổng hợp thành công chuỗi polypeptide và tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học của chuỗi polypeptide thu được trên mô hình chuột thí nghiệm.
4.2. KIẾN NGHỊ
1. Quá trình mô phỏng và đánh giá nên tiến hành song song với một mô hình polypeptide đã công bố.
2. Các thử nghiệm đánh giá cần phải thực hiện trên α – Cbtx đã tinh sạch. Phương pháp đề nghị trước khi thử trên chuột đó là: phân tích tương tác giữa peptide thiết kế với độc tố thần kinh α – Cbtx bằng phương pháp điện di không biến tính.
3. Trên cơ sở các kết quả đạt được, chúng tôi kiến nghị việc nên tiếp tục đầu tư cho đề tài ở các giai đoạn tiếp theo để hoàn thiện phần thiết kế polypeptide cũng như hoàn thiện phương pháp đánh giá, xác định hoạt tính ức chế độc tố nọc rắn thử nghiệm trên chuột.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Đặng Trần Hoàng, Trương Nam Hải (2006), “Tách các neurotoxin từ nọc rắn hổ mang Việt Nam (Naja naja)”, Tạp chí Hóa
học 44(4), 449-453.
2. Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Thanh Thuỷ, Nguyễn Huy Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Trương Nam Hải (2000), Biểu hiện gien mã hoá cho protein bất hoạt ribôxôm của mướp đắng trong nấm men Pichia pastoris, Báo cáo khoa
học Hội nghị Sinh học Quốc Gia, 44-47.
3. Lê Quang Huấn, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải, Đồng Văn Quyền, Lê Trần Bình (2000), Sử dụng kỹ thuật di truyền trong việc thu nhận các peptide tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn, Báo cáo khoa học Hội nghị Sinh học Quốc Gia, 89-93.
4. Trịnh Xuân Kiếm (1991), “Một số kết quả bước đầu trong chữa trị vết thương rắn cắn bằng kháng huyết thanh đặc hiệu”, Tin tức mới trong Y-Dược, 31-33. 5. Nguyễn Thị Thanh Lịch (2003), “Mô hình hóa cấu trúc phân tử α-amylase từ
Saccharomycopsis fibuligera có gắn cơ chất maltohexaose”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(2), 149-159.
6. Đỗ Ngọc Liên (2006), Sinh học phân tử màng tế bào, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, 165-173.
7. Nguyễn Hồng Thanh, Nguyễn Kim Tấn, Hoàng Ngọc Anh (2009), “Nghiên cứu các thành phần của nọc rắn hổ mang đất Naja kaouthia tại Việt Nam”, Tạp chí
sinh học, 31(2): 89-94.
Tiếng Anh
8. Alama, A. et al., (2011), "Inhibition of the Nicotinic Acetylcholine Receptors by Cobra Venom α-Neurotoxins: Is There a Perspective in Lung Cancer Treatment?", Plos one, 6(6), pp.20695.
9. Amiri, S. et al., (2005), "The α7 nicotinic acetylcholine receptor: Molecular modelling, electrostatics, and energetics", Molecular Membrane Biology, 22,
49
10. Antil-Delbeke, S. et al., (2000), "Molecular Determinants by Which a Long Chain Toxin from Snake Venom Interacts with the Neuronal α7-Nicotinic Acetylcholine Receptor", Journal of Biological Chemistry, 275(38), pp.29594 -29601.
11. Balass, M., Katchalski-Katzir, E. & Fuchs, S., (1997), "The α-bungarotoxin binding site on the nicotinic acetylcholine receptor: Analysis using a phage– epitope library", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94(12), pp.6054-6058.
12. Bourne, Y. et al., (2005), "Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha-neurotoxins and nicotinic receptors", The EMBO Journal, 24(8), pp.1512-1522.
13. Briggs, C.A. & McKenna, D.G., (1998), "Activation and inhibition of the human α7 nicotinic acetylcholine receptor by agonists", Neuropharmacology, 37(9),
pp.1095-1102.
14. Chen, R. & Weng, Z., (2003), "A novel shape complementarity scoring function for protein-protein docking", Proteins, 51(3), pp.397-408.
15. Chen, R., Li, L. & Weng, Z., (2003), "ZDOCK: an initial-stage protein-docking algorithm", Proteins, 52(1), pp.80-87.
16. Chen, R., Mintseris, J., et al., (2003), "A protein-protein docking benchmark",
Proteins, 52(1), pp.88-91.
17. Cruz, L.S., Vargas, R. & Lopes, A.A., (2009), "Snakebite envenomation and death in the developing world", Ethnicity & Disease, 19(1), pp.1-6.
18. Dani, J.A., (2001), "Overview of nicotinic receptors and their roles in the central nervous system", Biological Psychiatry, 49(3), pp.166-174.
19. Dutertre, S. & Lewis, R.J., (2006), "Toxin insights into nicotinic acetylcholine receptors", Biochemical Pharmacology, 72(6), pp.661-670.
20. Endo, T. & Tamiya, N., (1987), "Current view on the structure-function relationship of postsynaptic neurotoxins from snake venoms", Pharmacology
& Therapeutics, 34, pp.403-406.
21. Fruchart-Gaillard, C. et al., (2002), "Experimentally based model of a complex between a snake toxin and the α7 nicotinic receptor", Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(5), pp.3216 -3221.
50
22. Gabb, H.A., Jackson, R.M. & Sternberg, M.J., (1997), "Modelling protein docking using shape complementarity, electrostatics and biochemical information", Journal of Molecular Biology, 272(1), pp.106-120.
23. Grant, Gregory A., (1998), "Structure, Function, and Biophysical Aspects of k- Neurotoxins", Toxin Reviews, 17, pp.239-260.
24. Haripriya, M., Gundla, R. & Jagarlapudi, S., (2010), "Modeling of human CASPASE-5 protein and docking studies of CASPASE-5 inhibitors against modeled CASPASE-5", Journal of Global Pharma Technology, 2(7).
25. Huang, H.-J., Tsai, F.-J. & Chen, C.Y.-C., (2010), "Drug design for Influenza A virus subtype H1N1", Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 41(1), pp.8-15.
26. Huang, S.-Y., Grinter, S.Z. & Zou, X., (2010), "Scoring functions and their evaluation methods for protein–ligand docking: recent advances and future directions", Phys. Chem. Chem. Phys., 12(40), pp.12899-12908.
27. Karlin, A. & Akabas, M.H., (1995), "Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins" Neuron, 15(6), pp.1231-
1244.
28. Kim, J.-H. et al., (2011), "Ligand supported homology modeling and docking evaluation of CCR2: docked pose selection by consensus scoring", Journal of
Molecular Modeling, 17(10), pp.2707-2716.
29. Kini, R.M., (2005), "Structure-function relationships and mechanism of anticoagulant phospholipase A2 enzymes from snake venoms", Toxicon official journal of the International Society on Toxinology, 45(8), pp.1147-
1161.
30. Koh, D.C.I., Armugam, A & Jeyaseelan, K, (2006), "Snake venom components and their applications in biomedicine", Cellular and Molecular Life Sciences:
CMLS, 63(24), pp.3030-3041.
31. Lorenzen, S. & Zhang, Y., (2007), "Identification of near-native structures by clustering protein docking conformations", Proteins, 68(1), pp.187-194.
32. Mandell, J.G. et al., (2001), "Protein docking using continuum electrostatics and geometric fit", Protein Engineering, 14(2), pp.105-113.
33. McLane, M.A. et al., (1998), "Viper venom disintegrins and related molecules",
Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, Society for Experimental Biology and Medicine (New York, N.Y.), 219(2), pp.109-119.
51
34. McLaughlin, J.T. et al., (2009), "Conformational changes in alpha 7 acetylcholine receptors underlying allosteric modulation by divalent cations", BMC Pharmacology, 9, p.1.
35. McRobb, F.M. et al., (2010), "Homology Modeling and Docking Evaluation of Aminergic G Protein-Coupled Receptors", J. Chem. Inf. Model., 50(4),
pp.626-637.
36. Meng, Q.-X., Wang, W.-Y., Lu, Q.-M., Jin, Y., Wei, J.-F., Zhu, S.-W. & Xiong, Y.-L., (2002), "A novel short neurotoxin, cobrotoxin c, from monocellate cobra (Naja kaouthia) venom: isolation and purification, primary and secondary structure determination, and tertiary structure modeling",
Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 132(1), pp.113-121.
37. Moise, L. et al., (2002), "NMR Structural Analysis of α-Bungarotoxin and Its Complex with the Principal α-Neurotoxin-binding Sequence on the α7 Subunit of a Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor", Journal of Biological Chemistry, 277(14), pp.12406 -12417.
38. Nirthanan, S. & Gwee, M.C.E., (2004), "Three-finger alpha-neurotoxins and the nicotinic acetylcholine receptor, forty years on", Journal of Pharmacological Sciences, 94(1), pp.1-17.
39. Phui Yee, J.S. et al., (2004), "Snake postsynaptic neurotoxins: gene structure, phylogeny and applications in research and therapy", Biochimie, 86(2),
pp.137-149.
40. Plewczynski, D., Łaźniewski, M., Augustyniak, R., et al., (2011), "Can we trust docking results? Evaluation of seven commonly used programs on PDB bind database" Journal of Computational Chemistry, 32(4), pp.742-755.
41. Plewczynski, D., Łaźniewski, M., von Grotthuss, M., et al., (2011), "VoteDock: consensus docking method for prediction of protein-ligand interactions",
Journal of Computational Chemistry, 32(4), pp.568-581.
42. Shen, M.-yi & Sali, A., (2006), "Statistical potential for assessment and prediction of protein structures" Protein Science, 15(11), pp.2507-2524.
43. Takacs, Z., Wilhelmsen, K.C. & Sorota, S., (2001), "Snake alpha-neurotoxin binding site on the Egyptian cobra (Naja haje) nicotinic acetylcholine receptor Is conserved", Molecular Biology and Evolution, 18(9), pp.1800-1809.
52
44. Torres, A.M. et al., (2003), "Identification of a Novel Family of Proteins in Snake Venoms: pureification and structural characterization of nawaprin from Naja nigricollis snake venom", J. Biol. Chem., 278(41), pp.40097-40104.
45. Tsunoyama, K. & Gojobori, T., (1998), "Evolution of nicotinic acetylcholine receptor subunits", Molecular Biology and Evolution, 15(5), pp.518 -527. 46. Vakser, I.A., (1997), "Evaluation of GRAMM low-resolution docking
methodology on the hemagglutinin-antibody complex", Proteins, Suppl 1,
pp.226-230.
47. Walkinshaw, M.D., Saenger, W. & Maelicke, A., (1980), "Three-dimensional structure of the “long” neurotoxin from cobra venom", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77(5),
pp.2400-2404.
48. Wei, J.-F. et al., (2003), "Alpha-neurotoxins of Naja atra and Naja kaouthia
snakes in different regions", Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao
Acta Biochimica Et Biophysica Sinica, 35(8), pp.683-688.
49. Weiland, S., Bertrand, D. & Leonard, S., (2000), "Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: from the gene to the disease", Behavioural Brain Research, 113(1-2), pp.43-56.
50. Young, G.T. et al., (2008), "Potentiation of α7 Nicotinic Acetylcholine Receptors via an Allosteric Transmembrane Site", Proceedings of the National Academy