3.1. đỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ựược tiến hành với ựối tượng là lợn Mường và lợn Rừng ựược mua tại Lạng Sơn và tỉnh Hòa Bình.
Tuổi của lợn nghiên cứu từ 12 Ờ 14 tháng tuổi và có trọng lượng khoảng 14kg.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ựược tiến hành tại Bộ môn Tổ chức - Giải phẫu khoa thú y trường đại học Nông nghiệp Hà Nội từ tháng 8/2013 ựến tháng 4/2014.
Nghiên cứu cấu tạo vi thể các cơ quan: thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già và gan của lợn Mường và lợn Rừng.
Xác ựịnh kắch thước vi thể các cơ quan: thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già và gan của lợn Mường và lợn Rừng.
So sánh cấu tạo và kắch thước vi thể các cơ quan của lợn Mường và lợn Rừng.
3.3. VẬT LIỆU 3.3.1. Mẫu cơ quan 3.3.1. Mẫu cơ quan
Mẫu cơ quan ựược sử dụng trong nghiên cứu là: thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già, gan, của lợn Rừng và lợn Mường .
Các lấy mẫu bao gồm các bước sau:
-Bước 1: đặt lợn nằm trên bàn mổ, dùng dao cắt da và các cơ trong nách tới khớp xương bả vai và kéo dài ựến cằm cả hai bên, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Cho lợn nằm ở tư thế nằm ngửa.
- Bước 2: Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng ựể bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
- Bước 3: Cắt tách lưỡi, thực quản, khắ quản, phổi, cuối cùng cắt ựứt thực quản, mach quản giáp với cơ hoành. Kéo toàn bộ hệ thống dạ dày, ruột ra ngoài ựể tiến hành lấy mẫu dạ dày, ruột non, ruột già làm tiêu bản vi thể.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 28
3.3.2. Hoá chất
Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể: formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin, thuốc nhuộm Eosin, natribicacbnat, HCl, baume canada,Ầ
3.3.3. Dụng cụ
Máy ựúc tự ựộng, máy cắt Microton, máy chụp ảnh tiêu bản,.... Các dụng cụ khác gồm: lam kắnh, lamen, KHV, tủ ấm,Ầ
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
để quan sát cấu tạo vi thể của các tổ chức, ta tiến hành làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc mẫu bằng parafin sau ựó nhuộm HE (Hematoxilin - Eosin). Cuối cùng, tiêu bản ựược quan sát trên KHV.
3.4.1. Xử lý mẫu và tạo slide
* Bước 1: cố ựịnh mẫu
Sau khi lấy ựược mẫu ta tiến hành ngâm mẫu vào dung dịch formol 10%, thời gian tối thiểu là 3 ngày.
* Bước 2: vùi mẫu
Rửa focmol: rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng.
Bảng 3.1. Quy trình chuyển ựúc mẫu tự ựộng
STT Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600 1:00 2 Cồn 700 1:00 3 Cồn 800 1:00 4 Cồn 900 1:00 5 Cồn 950 2:00 6 Cồn 1000 6:00 7 Cồn 1000 6:00 8 Cồn 1000 6:00 9 Xylen 1 4:00 10 Xylen 2 4:00 11 Parafin 1 12:00 12 Parafin 2 24:00
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 29
Tổng cộng 68
* Bước 3: ựúc block
đúc tổ chức trong parafin nóng chảy. * Bước 4: cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy Microtom, ựộ dày của lát cắt 2 Ờ 5ộm.
Tãi mảnh: dàn lát cắt bằng phẳng ựặt trên mặt cốc nước lạnh sau ựó sử dụng phiến kắnh ựể vớt lát cắt ra, ựặt lát cắt trên mặt cốc nước ấm 480C. Dùng phiến kắnh sạch vớt ra rồi ựặt lên giá sấy cho khô nước. Sau ựó ựể tủ ấm 370C qua một ựêm là có thể ựem nhuộm ựược.
3.4.2. Nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE)
Quy trình nhuộm ựược thực hiện qua 4 bước cơ bản:
- Khử paraffin: tiêu bản ựược nhúng vào xylen qua 3 bình khác nhau với tổng thời gian ắt nhất là 2 giờ sau ựó làm mất xylen và lấy lại nước trong tổ chức bằng cách nhúng tiêu bản lần lượt qua các cốc ựựng cồn có nồng ựộ từ cao xuống nồng ựộ thấp: cồn 95%, cồn 70%, cồn 50% (mỗi cốc 1 lần, mỗi lần 5 phút). Cuối cùng rửa tiêu bản bằng nước cất trong 5 phút.
- Nhuộm Hematoxinlin: tiêu bản sau bước 1 ựược nhuộm Haematoxilin bằng cách nhỏ Hematoxilin lên tiêu bản và ựể trong khoảng 7 phút tiếp theo ựược rửa nước cất sau ựó soi trên KHV ựể kiểm tra sự bắt màu Hematoxilin của tổ chức. Khi thấy tổ chức có màu xanh tắm than là ựược. Nếu sau khi nhuộm Hematoxilin, quan sát thấy nhân tế bào hơi mờ thì nhúng vào dung dịch natribicacbonat 1% trong khoảng 30 giây. Nếu tiêu bản quá ựậm thì nhúng nhanh tiêu bản qua dung dịch axit chlohydric loãng. Nếu sau ựó nhạt quá thì rửa nước và nhuộm lại bằng Hematoxilin.
- Bước nhuộm Eosin: nhỏ dung dịch Eosin ngập lên mặt tiêu bản và ựể khoảng 2 phút. Rửa nước sau ựó soi trên KHV ựể kiểm tra sự bắt màu Eosin của tổ chức. Khi thấy tổ chức có màu hồng ựỏ là ựược. Nếu sau khi nhuộm Eosin, quan sát thấy phần bào tương hơi mờ thì nhuộm lại bằng Eosin sau ựó làm mất nước bằng cách rửa tiêu bản qua cồn tuyệt ựối, loại bỏ cồn bằng cách nhúng qua xylen 3 lần (tổng thời gian là 2 giờ). Kết thúc bước này bằng cách nhỏ một giọt baume
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫncòn xylen trên tiêu bản.
- Kiểm tra trên KHV: kiểm tra tiêu bản trên KHV, quan sát, chụp ảnh và ựo kắch thước các lớp tổ chức. Mỗi chỉ tiêu của một lớp tổ chức ựược ựo 3 lần ở các vị trắ khác nhau của lớp tổ chức ấy, sau ựó lấy kết quả trung bình.
Trong quá trình thực tập tại bộ môn Giải phẫu Ờ Tổ chức, chúng tôi ựã tiến hành cắt và nhuộm tiêu bản vi thể các cơ quan của lợn Mường và lợn Rừng, Số lượng ựược trình bảy ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Số lượng tiêu bản các cơ quan của lợn Mường và lợn Rừng
Lợn Mường Lợn Rừng
Lợn
Cơ quan (n) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2
Thực quản 3 5 3 5 7 Dạ dày 43 13 15 13 15 Ruột non 12 11 12 7 11 Ruột già 5 4 10 6 8 Gan 9 18 5 7 12 Tổng 72 51 45 38 53 3.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Kắch thước tiêu bản ựược ựo bằng KHV nối với camera có gắn thước ựo và sử dụng phần mềm Future WinJoe.
Ở mỗi ảnh chụp tiêu bản, ta ựếm ựược số vạch từ ựó tắnh ựược giá trị trung bình, phương sai bằng phần mềm Excel và sau ựó quy ựổi ra ộm tương ứng với vật kắnh 5, vật kắnh 10, vật kắnh 40.
+ Công thức tắnh giá trị trung bình
n x m n x m x m x m x i i k i k k ∑ = = + + + = 1 1 2 2 ... 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 31 Trong ựó: x là giá trị trung bình
i
m là số lần lặp lại của một kắch thước
i
x là kắch thước ựo ựược n là tổng số lần ựo + Công thức tắnh phương sai
2 1 2 ) ( n x x m s k i i i ∑ = − =
+ Tiêu bản ựược ựo bằng 2 thước 50 x 40 và 70 x 50, cách quy ựổi của mỗi thước :
* Thước 50 x 40:
+ Vật kắnh 5: 1mm = 103ộm = 48 vạch của camera có gắn thước ựo. + Vật kắnh 10: 1mm = 103ộm = 95 vạch của camera có gắn thước ựo. + Vật kắnh 40: 0.26mm = 0.26 * 103ộm = 100 vạch của camera có gắn thước ựo.
* Thước 70 x 50:
+ Vật kắnh 5: 1mm = 103ộm = 67 vạch của camera có gắn thước ựo. + Vật kắnh 10: 1mm = 103ộm = 133 vạch của camera có gắn thước ựo. + Vật kắnh 40: 0.26mm = 0.26 * 103ộm = 140 vạch của camera có gắn thước ựo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 32