TỪNG ISOFLAVONE GLYCOSID RIÊNG[34]
3.2.1. Chiết xuất:
Khoảng 909 g bột đậu nành sau khi đã được loại chất béo được chiết với 2 lít methanol ở nhiệt độ 550C trong 30 phút, khuấy bằng con cá khuấy từ. Sau đó, các phần tử rắn được loại ra khỏi dịch chiết bằng cách lọc. Bả đậu nành thu được chiết lại 4 lần nữa với 2 lít methanol/lần, điều kiện chiết xuất như lần đầu. Sau khi lọc loại bả, 5 dịch chiết được gôm lại thành dịch chiết toàn phần thô.
Dịch chiết thô được phân tích bằng hệ thống HPLC, kết quả cho thấy trong dịch chiết thô có khoảng 485 mg daidzin và 636 mg genistin. Hai pic ra trước hơn được xác định là 6״-O-malonyl daidzin và 6״-O-malonyl genistin.
3.2.2. Phân lập bằng sắc ký cột pha đảo:
Khoảng 9 lít dịch chiết methanol được hòa với nước cất đến khi đạt hỗn hợp 20% methanol trong nước. Sau đó mẫu được nạp lên cột polymethacrylate 4״ x 70״ và rửa giải với pha động có phần trăm methanol trong nước tăng dần là 50%, 60% và 70%. Thể tích hứng là 100 ml/ lần và được đánh số thứ tự 0,1; 0,2; 0,3; 0,4… các phân đoạn được đem phân tích thành phần nhằm phát hiện isoflavone bằng hệ thống HPLC.
Ở tỉ lệ pha động đầu tiên, ta quan sát thấy sự hiện diện của các isoflavone lần lượt ở các phân đoạn thu được:
- 6״-O-malonyl daidzin: phân đoạn 0-1,3 - 6״-O-malonyl genistin: phân đoạn 1-1,6 - Daidzin: phân đoạn 3,5-6,1
- Genistin được rửagiải khỏi cột ở tỉ lệ methanol-nước là 60%, phân đoạn 7,0- 10,0.
Các phân đoạn lần lượt được cô thu hồi dung môi cho đến khi cắn khô, ta có: 396 mg daidzein và 515 mg genistin.
Genistein thô ( độ tinh khiết là 63%) và daidzin thô (độ tinh khiết 62%) lần lượt được hòa tan trong methanol, sau đó thêm than hoạt để loại màu dung dich.Than hoạt được loại ra khỏi dung dịch bằng cách lọc. Dung dịch sau đó được cô thu hồi dung môi cho đến cắn khô, hòa tan trở lại trong lượng MeOH vừa đủ và để kết tinh trong tủ lạnh. Thu kết tinh bằng cách lọc qua phễu thủy tinh sốp.
Kết quả: tinh thể daidzin thu hồi được có độ tinh khiết là 97% và tỉ lệ phục hồi là 80%. Genistin với độ tinh khiết là 97% và tỉ lệ phục hồi là 72%.
3.2.4. Thủy phân tinh thể daidzin và genistin:
Deidzin và genistin được đun hồi lưu với một lượng HCl 4N trong 5 giờ ở 1050±50C. daidzein và genistein (sản phẩm thủy phân của daidzin và genistin) kém tan trong nước, nên kêt tinh lại. Lọc để thu daidzein và genistein. Tỉ lệ phục hồi của daidzein vf genistein sau thủy phân lần lượt là 92% và 75%. Sản phẩm thu được sau đó được hòa tan lại và kết tinh trong MeOH.
Kết quả: Thu được daidzein và genistein có độ tinh khiết là 99%, tỉ lệ phục hồi lần lượt là 77% và 63%.
Sơ đ ồ 4: s ơ đồ p hâ n lậ p is of la vo ne từ đ ậu n àn h (p hư ơn g ph áp 2 )
Chương 4 – BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, isoflavone được chiết xuất và tinh chế từ bột đậu nành. Vì isoflavone tồn tại chủ yếu trong đậu nành ở dạng glycoside[36], nhưng glycone có tác dụng sinh học mạnh hơn và được hấp thu dễ dàng hơn so với dạng glycoside tương ứng[18]. Do đó, thủy phân là một bước cần thiết để nâng cao tác dụng sinh học cũng như khả năng hấp thu của các chế phẩm từ đậu nành.
Dung môi chiết xuất được chọn là EtOH và MeOH, do khả năng hòa tan và sự bền vững của nhóm isoflavone trong alcol.
Tác nhân thủy phân trong cả hai phương pháp đều được lựa chọn là acid HCl vì hiệu quả thủy phân của chúng cũng như khả năng được loại bỏ dễ dàng trong những bước tiếp theo trong quy trình phân lập. Tuy nhiên, để đảm bảo acid HCl được loại bỏ hoàn toàn khỏi sản phẩm cuối cùng, thì nồng độ acid sử dụng không được quá cao (trong khi nếu nồng độ acid thấp quá thi sự thủy phân không hiệu quả), và nồng độ acid tối ưu sau khi được khảo sát được khuyến cáo nên là 0,13 mol/l[31]. Trong phương pháp 2[34] , nồng độ acid được sử dụng cao hơn rất nhiều: 4N. Để thu được thu được sản phẩm tinh khiết, tác giả đã phải chiết lại với diethyl ether và sản phẩm thu được có độ tinh khiết rất cao (99%)[34]. Một phương pháp để thủy phân isoflavone dạng glycoside thành dạng aglycone cũng được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều là thủy phân bằng enzyme β-glucosidase (một enzyme có trong đậu nành)[32]. Ưu điểm của phương pháp này là an toàn, không cần lo sợ dư lượng acid tồn lại trong sản phẩm cuối cùng, tiết kiệm được năng lượng ( do nhiệt độ thấp- khoảng 500C). Nhưng một nhược điểm của nó là chỉ thủy phân được acetyl-glycosid mà không tác động trên malonyl- glycosid[33], do đó không thể thủy phân hoàn toàn, hơn nữa phương pháp này phụ thuộc vào hàm lượng β-glucosidase trong đậu nành, điều này không có lợi cho sản xuất công nghiệp do tác nhân thủy phân không ổn định, khó đạt độ đồng nhất giữa các lô. Quá trình tinh chế sản phẩm: phương pháp 1: thực hiện đơn giản bằng cách kết tinh isoflavone toàn phần trong nước cất. Nguyên tắc là dựa vào tính tan của isoflavone
trong các dung môi khác nhau. Độ tan của isoflavone dạng aglycone trong nước kém hơn nhiều so với độ tan trong EtOH.
Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Nhìn chung, phương pháp 1 thực hiện đơn giản hơn phương pháp 2. Trước hết, ở phương pháp 1, ta thủy phân isoflavone dạng glycoside ngay từ đầu, điều này có lợi vì ta chỉ cần thủy phân 1 lần duy nhất cho tất cả các isoflavone, do đó ta có thể tiết kiệm được thời gian và công sức. Thứ hai, ở phương pháp thứ nhất ta sử dụng những kĩ thuật đơn giản nhưng hiệu quả như là kết tinh trong nước, sử dụng phương pháp lọc để loại tạp… thay vì dùng những phương tiện tốn kém hơn như: chiết lắc nhiều lần, sắc ký, ly tâm… vì thế thích hợp với quy mô sản xuất công nghiệp hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]: Herman, C., Adlercreutz et al.(1995) Soybean phytoestrogen intake and cancer risk. J. Nutr. 125: 757S–770S.
[2]: Adlercreutz et al. (1992) Dietaryphyto-oestrogen and the menopause in Japan
(letter). Lancet. 339: 1233.
[3]: Lee et al.(1991), Dietary effects on breast-cancer risk in Singapore. Lancet 337: 1197–1200.
[4]: Severson et al. (1989) A prospective study of demographics and prostate cancer among men of Japanese ancestry in Hawaii. Cancer Res. 49: 1857–1860.
[5]: Watanabe, S. & Koessel (1993) Colon cancer: an approach from molecular epidemiology. J. Epidemiol. 3: 47– 61.
[6]: Knight, D. C. & Eden, J. A. (1996) A review of the clinical effects of phytoestro- gens. Obstet. Gynecol. 87: 897–904.
[7]: Strauss, L.; Santti, R. et al.(1998) phytoestrogens and their role in hormonally dependent disease. Toxicol. Lett., 102-103, 349-354.
[8]: Adlercreutz, H.; Hamalainen, E.; Gorbach, S.; Goldin, B.(1992) Dietary phyto- oestrogens and the menopause in Japan. Lancet, 339(8803), 1233.
[9]: Clarkson, T. B.; Anthony, M. S.; Hughes, C. L. Estrogenic soybean isoflavones and chronic disease: risks and benefits. Trends Endocrinol. Metab. 1995, 6,11-16. [10]: Brandi, M. L. Phytoestrogens and menopause. EnViron. Toxicol.Pharmacol. 1999, 7, 213-216.
[11]: Dantas, S. M. Menopausal symptoms and alternative medicine-Evaluation by ambulatory monitoring. Primary Care Update for OB/GYNS 1999, 6 (6), 212-220. [12]: Stopper, H.; Schmitt, E.; Kobras, K. Genotoxicity of phyto-estrogens. Mutat. Res. 2005, 574 (1-2), 139-155.
[13]: Izumi, T., Nasu A. et al. (1997) An efficient preparation of acetyl isoflavone glucoside. Chem. Pharm. Bull. 45:1593–1595.
[14]: Kudou, S., Fleuly, Y. et al. (1991a) Malonyl isoflavone glycosides in soybean seeds (Glycine max Merrill). Agric. Biol. Chem. 55: 2227–2233.
[15]: Kudou, S., Shimoyanagi, et al. (1991b) A new isoflavone glycoside in soybean seed (Glycine max Merrill), glycitein 7-O-b-D-(60-O-acetyl)-glucopyranoside. Agric. Biol. Chem. 55: 859 – 860
[16]: Ohta, N., Kuwata, G., et al. (1980) Isolation of a new isoflavone acetylglucoside, 60-O-acetylgenistin, from soybeans. Agric. Biol.Chem. 44: 469 – 470.
[17]: Naim, M., Gestetner, B. et al. (1973) A new isoflavone from soya beans. Phytochemistry 12: 169 –170.
[18]: Toru Izumi et al., Soy Isoflavone Aglycones Are Absorbed Faster and in Higher Amounts than, J. Nutr. 130: 1695–1699 (2000).
Their Glucosides in Humans
[19]: Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục. [20]: Danh mục các loài thực vật Việt Nam, tập II.
[21]: Trương Thị Đẹp(2007), Thực vật Dược, Bộ môn thực vật, khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, trang 231
[22]: Võ Văn Chi-Trần Hợp (2002), Cây cỏ có ích Việt Nam, NXB Giáo Dục ,trang 659-660.
[23]: http://www.suabot.vn/cac-loai-sua-khac/394-sua-dau-nanh-giup-giam-
cholesterol.html, sữa đậu nành giúp giảm cholesterol, tham khảo ngày 24/11/2011. [24]: http://alobacsi.vn/20110325024832629p168c239/tac-dung-chua-benh-cua-dau nanh.htm [25]: http://old.thuvienhoasen.org/daunanh-nguondinhduongtuyethao-01.htm [26]: http://bacsi.khoe24.vn/kien-thuc-san-pham/thong-tin-hoat-chat/172-isoflavones- dau-nanh.html [27]: http://d.violet.vn/uploads/resources/561/624343/preview.swf [28]: http://www.ykhoanet.com/binhluan/nguyenvantuan/33.htm
[29]: Gs.Ts. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam , NXB y học , trang 930 -932,2004.
[30]: http://vietbao.vn/Suc-khoe/Dau-nanh-Ngua-ung-thu-giam-soi-than /1735086201/ 250
[31]: ELIZABETH JINGNAN ZHANG,KA MING NG et al., Extraction and Purification of Isoflavones from Soybeans and Characterization of Their Estrogenic Activities, J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6940−6950
[32]: Mercedes C. Carrão-Panizzi et al., Hydrothermal Treatments in the Development of Isoflavone Aglycones in Soybean (Glycine max (L.) Merrill) Grains, Brazilian Archives of Biology and Technology, ISSN 1516-8913 , Vol.47, n. 2 : pp. 225-232, June 2004
[33]: TAI-YING CHIOU, YI-HSUAN LIN et al., β-Glucosidase Isolated fromSoybean Okara Shows Specificity, J. Agric. Food Chem. DOI:10.1021/jf101848x, 2010, 58, 8872–8878
[34]: Zheng et al., Process for the isolation and purification of isoflavones, United States Patent, 5,679,806 (1997)
[35]: Li-ping Qu, Guo-rong Fan, Isolation of six isoflavones from Semen sojae
[36]: Naim, M.; Gestetner, B.; Zilkah, S. Soybean isoflavones characterization, determination, and antifungal activity. J. Agric.Food Chem. 1974, 22, 806-810.