3.1 Vật liệu
3.1.1 Chủng nấm
Các chủng nấm Le85, 8514, L43, 85K, 1014 và 1305 thuộc bộ chủng của Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các chủng này được phân lập từ các mẫu đất, lá cây, côn trùng chết từ các vùng địa lí khác nhau. Chủng VTCC (1037, 1039) được cung cấp bởi Bảo tàng chủng vi sinh vật gốc, Viện vi sinh và Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội.
3.1.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Hóa chất chính dùng trong thí nghiệm
Tên hóa chất Hãng sản xuất
Agar Việt Nam
Agarose Bio Basic Inc (Mỹ)
Boric acid Bio Basic Inc (Mỹ)
Peptone Bio Basic Inc (Mỹ)
Tween 20 BioBasic Inc (Mỹ)
Tween 80 BioBasic Inc (Mỹ)
Yeast extract (cao nấm men) Bio Basic Inc (Mỹ)
Calciumchloride Dihydrate Merck (Đức)
Natrium dihydrogenphosphate dihydrate Merck (Đức)
Natriumacetate-trihydrate Merck (Đức)
Ammonium chloride China
Ammonium nitrate China
Kali chloride China
Maganesium sulfate heptahydrate China
Triton X-100 Sigma (Mỹ)
3.1.3 Dung dịch và đệm
Các dung dịch hóa chất và đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.2.
Thành phần hóa chất, nồng độ, cách pha được thực hiện theo hướng dẫn của các bài báo đã được công bố.
Bảng 2.2. Các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Nồng độ, chất hóa học
Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8
Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS
Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
Amp gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide
Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8
Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) Xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Đệm 10x TBE 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8 Dung dịch isopropanol 99%
Chloroform:isoamylalcohol 24:1
3.1.4 Môi trường
Potatoes dextrose (PD) lỏng: 20% dịch chiết khoai tây, 2% glucose (w/v), 0,6% KNO3 (w/v). PD rắn, môi truờng PD lỏng được bổ sung 2% agar (w/v).
Luria-Bertani (LB) lỏng: 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men, 1% (w/v)
NaCl, pH 7,5. LB rắn, môi trường LB lỏng được bổ sung 2% agar (w/v). Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trường được bổ sung 100 µg ampicillin/ml.
Tất cả các môi trường lỏng, đặc dùng cho nuôi cấy vi sinh đều được khử trùng ở khử trùng 121°C trong 15 phút.
3.1.5 Thiết bị thí nghiệm
Bảng 2.3. Các thiết bị dùng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt Trung Quốc
Box cấy LB-1234 Việt Nam
Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sĩ)
Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ)
Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản)
Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy PCR Eppendorf (Đức)
Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sĩ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4°C, -20°C, -84°C Toshiba, Sanyo (Nhật Bản)
Kính hiển vi Trung quốc
Máy li tâm lớn Hitachi
3.2 Phương pháp
3.2.1 Sàng lọc chủng nấm có khả năng diệt rệp đào
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA, sau 7 ngày tiến hành thu bào tử bằng dung dịch 0,05% Tween 80 để tách bào tử ra khỏi sợi nấm. Rệp đào ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi được nuôi trên lá cải thảo đặt vào trong hộp kích thước 30x20x20 cm3 duy trì ở 23-27°C và độ ẩm 80-85%. 15 ml dung dịch bào tử nấm (3x108/ml) pha trong 0,05% Tween 80, được phun dạng sương lên lá cải đã có 25 con rệp, với khoảng cách từ rệp đến miệng vùi phun khoảng 25 đến 30 cm. Lô đối chứng chỉ phun 15 ml dung dịch 0,05% Tween 80. Lá cải có rệp sau khi được phun đặt vào trong hộp. Hàng ngày theo dõi số lượng rệp chết bởi nấm (quan sát trong 7 ngày), làm cơ sở đánh giá khả năng diệt rệp của nấm.
3.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử Tách chiết DNA tổng số
Chủng nấm 8514 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở 25°C, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày. Dịch nuôi được li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4°C. Bỏ dịch, thu thể sợi rồi nghiền nhanh trong nitơ lỏng, bổ sung 600 µl đệm phá tế bào, lắc nhẹ và thêm 65 µl dung dịch lysozyme, ủ ở 37°C trong 30 phút. Sau đó hỗn hợp được bổ sung 5 µl protease K ủ 2 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform: isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên
°
giờ. Tủa thu được sau khi ly tâm 12000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút được làm khô dưới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C.
Khuếch đại PCR
Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mỹ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm 8514 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') được sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl 25 mM MgCl2; 2,5 µl đệm10x PCR; 0,35 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm đến tổng thể tích 25 µl.
Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/5′, 35x (95°C/1′, 52°C/1′, 72°C/1′); 72°C/10′.
Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 được thực hiện theo chỉ dẫn của Fermentas. Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp được ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C tạo plasmid tái tổ hợp.
Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến
Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được cấy chuyển vào 3 ml môi trường
LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 100 ml môi trường LB được tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm như trên. Tủa tế bào lại được hòa đều trong 40 ml 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại được hòa vào 4-5 ml 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol được chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C.
Lấy tế bào khả biến E. coli DH5α từ tủ -80°C, đặt trong khay đá lạnh khoảng 10 phút. 5 μl plasmid mang gene ngoại lai được trộn với 40 μl dịch tế bào khả biến trong ống eppendorf, ủ 30 phút trên khay đá lạnh. Hỗn hợp được sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay vào khay đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trường LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp khoảng 45 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế bào đã biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc chứa 100 μg/ml ampicillin ủ qua đêm ở 37°C.
Tách chiết DNA plasmid
Một khuẩn lạc đã được biến nạp trên đĩa thạch LB/amp được cấy vào 3 ml môi trường LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu được sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút được lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II được bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp được bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500 vòng/phút trong. 450 µl pha trên được hút sang ống mới, bổ sung
°
plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút được rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid được hòa trong đệm TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.
Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
DNA plasmid tái tổ hợp được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua
đêm ở 37°C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y+ và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn gene DNA chèn vào plasmid được giải trình tự. Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.
3.2.3 Khảo sát một số yếu tố lên sinh bào tử trong lên men xốp
Sau khi sàng lọc, chủng có khả năng diệt rệp đào với hiệu quả cao nhất trong bộ chủng Lecanicillium spp. ở phần trên được chọn và nghiên cứu một số yếu tố lên khả năng sinh bào tử trong lên men xốp.
Nguồn cơ chất
Nấm được nuôi trên các nguồn cơ chất như ngô xay, bã mía, cám, mùn cưa, gạo tấm nhỏ, gạo tấm to, gạo nứt trong cùng nồng độ. Ở 25°C, sau 12 ngày lên men, bào tử được thu và xác định số lượng bào tử được sản xuất trên 1 g cơ chất.
Nguồn nitrogen
Chọn cơ chất có khả năng sinh bào tử cao từ thí nghiệm trên để sử dụng tối ưu nguồn nitrogen. Các nguồn nitrogen như peptone, bột đậu tương, NH4Cl, NH4NO3, KNO3, cao nấm men được bổ sung vào gạo đã ngâm trương (đã dáo nước) với tỷ lệ 1% (nguồn nitrogen/ gạo, w/w) trước khi khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Đối chứng cơ chất không bổ sung nguồn nitrogen. Bào tử chủng nấm được cấy vào cơ chất, lên men ở 25oC, sau 12 ngày tiến hành thu bào tử và xác định số lượng bào tử trên 1 g cơ chất.
Cơ chất được xử lí với các dung dịch đệm có pH 4-10. Sau đó gạo được để dáo nước rồi cho vào bình lên men, khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Bào tử chủng nấm được cấy vào cơ chất, lên men ở 25°C. Sau 12 ngày tiến hành thu bào tử và xác định số lượng bào tử trên 1 g cơ chất.
Độ thoáng khí
Cơ chất đã được ngâm, để dáo nước. Cân cơ chất với lượng 5; 10; 15; 20; 25; 30 và 40 g đưa vào bình tam giác dung tích 250 ml, khử trùng như trên. Bào tử chủng nấm được cấy vào cơ chất, lên men ở 25°C. Sau 12 ngày tiến hành thu bào tử và xác định số lượng bào tử trên 1 g cơ chất.
Đánh giá ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến khả năng tách bào tử
Các dung dịch Tween 20, Tween 80, Triton X-100 với nồng độ khác nhau 0,02; 0,05; 0,1% được sử dụng để nghiên cứu. Cân 1 gam cơ chất đã lên men 12 ngày đưa vào ống falcon dung tích 50 ml, thêm tiếp 24 ml dung dịch hoạt động bề mặt, lắc 200 vòng/phút trong 30 phút. Số lượng bào tử trên gam cơ chất được tách bởi dung dịch hoạt động bề mặt được xác định.
Đánh giá ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến khả năng nẩy mầm của bào tử
Bào tử thu được từ các dung dịch hoạt động bề mặt khác nhau được pha loãng đến nồng độ 107 bào tử/ ml. Hút 30 μl dung dịch bào tử trải đều lên lam kính đã phủ một lớp mỏng 1% agar (w/v). Ủ ở 25°C, sau 12 giờ và 24 giờ quan sát tỷ lệ nảy mầm của bào tử.
5 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
5.1 Sàng lọc chủng nấm Lecanicilliumspp. diệt rệp đào
Tám chủng nấm Le85, 8514, L43, 1039, 85K, 1037, 1014 và 1305 được khảo sát khả năng diệt rệp. Ở 20-22°C và độ ẩm 80-85%, sau 5 ngày phun bào tử, hai chủng Le85, 8514 diệt rệp tương ứng là 89% và 90%, trong khi đó rệp bị diệt bởi chủng L43 và 85K tương ứng là 87% và 88%. Các chủng nấm khác diệt được 28 đến 60%. Bên cạnh đó, ở 23-24°C và độ ẩm 80-85%, sau 5 ngày phun bào tử, ba chủng Le85, 8514, L43 diệt đựợc 92 đến 96% rệp. Ở 25-27°C và độ ẩm 80-85%, bốn chủng Le85, 8514, L43 và 85K diệt đựợc 100% rệp. Các chủng còn lại ở cùng điều kiện diệt được 28-60%. Như vậy, khả năng diệt rệp đào của các chủng nấm trên có sự khác biệt rõ rệt. Đặc biệt 3 chủng Le85, 8514 và L43 có khả năng diệt rệp hiệu quả 96 đến 100% ở khoảng nhiệt độ rộng 20-27°C, với cùng điều kiện độ ẩm. Khả năng diệt rệp đào, rệp bông ở phổ nhiệt độ rộng và độ ẩm thay đổi cũng đã được nghiên cứu trước đây bởi Vũ và cộng sự. Ở nhiệt độ 25°C, độ ẩm 75-85% chủng Lecanicillium spp. thể hiện độc lực cao đối với rệp cả rệp đào M. persicae và rệp bông A. gossypii, diệt rệp 100% sau 5 và 2 ngày phun (Vu et al., 2007a; Vu et al., 2007b).
A Ở 25-27oC và độ ẩm 80-85%
B Ở 20-22°C và độ ẩm 80-85%
C Ở 23-24°C và độ ẩm 80-85%
Hình 3.1. Khả năng diệt rệp đào của các chủng nấm Lecanicillium spp. ở 25-27°C và độ ẩm 80-85% (A), 20-22°C và độ ẩm 80-85% (B), 23-24°C và độ ẩm 80-85% (C). Bảng 3.1. Khả năng diệt rệp của các nấm kí sinh côn trùng trên
ở các điều kiện khác nhau sau 5 ngày.
Chủng Tỷ lệ rệp chết ở điều kiện thử nghiệm(%)
Le85 89 92 100 8514 90 96 100 L43 87 92 100 1309 28 28 28 85K 88 88 100 1037 36 32 40 1014 48 44 60 1305 60 56 56 ĐC 0 0 0
Dựa vào khả năng diệt rệp và LT50 (ngày), trong số các chủng diệt rệp mạnh, chủng 8514 thể hiện độc lực cao đối với rệp đào, diệt 100% sau 5 ngày phun với LT50 là 3,2 ngày (LT50 của chủng này thấp hơn các chủng nấm còn lại). Chủng nấm này được đọc trình tự 28S rRNA để định loài và nghiên cứu sinh bào tử trên môi trường lên men xốp.
C
Hình 3.2. Rệp phun đối chứng 0,05% Tween 80 (A), rệp chết bởi nấm trên lá rau cải (B), rệp chết
bởi nấm, chụp với kính hiển vi 10x (C).
5.2 Phân loại chủng nấm 8514dựa vào trình tự đoạn gene 28S rRNA
DNA tổng số của chủng 8514 sau khi tách chiết, được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Băng DNA khá sạch có thể dùng để khuếch đại gene bằng PCR. Cặp mồi NL1 và NL4 được sử dụng để nhân đoạn gene 28S rRNA. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Sau khi nhuộm ethidium bromide và soi dưới đèn UV, trên bản gel có một băng xuất hiện với kích thước khoảng 600 bp (hình 3.3B).
Hình 3.3: Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn là DNA tách chiết từ chủng 8514; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI. M: Marker
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pJET1.2 tạo ra plasmid tái tổ hợp pJ28S được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Các dòng plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel agarose, có 2 băng DNA kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với vector pJET1.2 và
600bp→ ←600bp
Plasmid mang đoạn gen mong muốn đã được tách và tinh sạch được đem đi đọc trình tự, sử dụng cặp mồi NL1 và NL4. Sau khi phân tích và sử lý số liệu, nhận được