M và NS của virus cúm A/H5N1
Bên cạnh các đột biến xảy ra trên các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1)
clade virus mới. Các đột biến xảy ra trên các gen NP, M và NS cùng với hiện tượng cắt – ghép gen, xảy ra ở các gen này trong hệ gen virus cúm A/H5N1, đều có liên quan đến độc tính và khả năng gây bệnh của virus.
Điều đặc biệt nguy hiểm là thông qua những đột biến này cùng với sự trao đổi chéo các phân đoạn gen trong hệ gen, giữa các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành sẽ tạo ra các chủng virus mới. Các chủng virus này sẽ có thể thu nhận và tăng cường khả năng gắn vào tế bào của người bị virus xâm nhiễm. Bên cạnh đó, rất có thể những biến đổi này cũng là bước chuẩn bị cho việc phân hóa dòng virus hiện tại thành những dòng virus khác. Bởi vì đã từng có tiền lệ cho thấy, virus A/H5N1 phân hóa thành những dòng virus khác nhau như ở Trung Quốc từ 1997 tới năm 2001 có tới 6 dòng virus A/H5N1 lưu hành trên thủy cầm (đó là các dòng A, D, C, D, E và Xo). Thế nhưng đến năm 2002, xuất hiện 8 dòng virus mới là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ được xác định. Cho đến nay phân type H5N1 type Z tồn tại và tiếp tục lưu hành cũng như gây dịch trên người và gia cầm và gần đây là type G, còn các type khác thì không thấy xuất hiện.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân tích và tìm hiểu các đặc tính di truyền ở các phân đoạn gen M, NP và NS của virus cúm A/H5N1, góp phần đánh giá khả năng biến đổi và thích nghi lây nhiễm từ gia cầm sang người, cũng như những biến đổi di truyền liên quan đến gia tăng độc lực và khả năng kháng thuốc của các chủng virus mới. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng góp phần bổ sung dữ liệu di truyền giám sát dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1, làm cơ sở để nghiên cứu sản xuất vaccine thế hệ mới phòng chống dịch cúm A/H5N1 đang có diễn biến ngày càng trở nên phức tạp hiện nay.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
Thu thập các mẫu bệnh phẩm là dịch nhày biểu mô (swab) niêm mạc hầu- họng-khí phế quản của vịt nhiễm bệnh tại các địa phương có dịch năm 2011. Mẫu được vô hoạt bằng nhiệt độ cao (đun sôi trong vài phút) và bảo quản -70oC theo tiêu chuẩn an toàn sinh học.
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
-Máy PCR (máy PTC-100) của MJ. Research Inc.
- Máy ly tâm lạnh. Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- DOC (Wealtech- Mỹ). Bộ điện di DNA (Bio-Rad). Máy lắc có điều nhiệt, máy khuấy từ, máy vortex. Lò vi sóng Samsung, box Laminair vô trùng, tủ lạnh -20oC và -80oC (Sanyo-Nhật Bản). - Bộ pipetman (10 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl) và đầu côn các loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, và ống nuôi vi khuẩn.
2.1.3. Hóa chất
- Hoá chất: Yeast Extract và trypton (DIFCO-Mỹ); EDTA, SDS, Tris-HCl (Sigma-Mỹ); Acid acetic (Merk-Đức); X-gal (Sigma-Mỹ); Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức); Agar (Sigma, Mỹ); Agarose (Sigma, Mỹ); cồn tuyệt đối, BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ).
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số “QIAamp Viral RNA Mini Kit”, bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR, bộ kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen); bộ kit tách plasmid tái tổ hợp “QIAprep Spin Miniprep Kit”, kit tinh sạch sản phẩm PCR đều do hãng QIAGEN cung cấp.
- Các mồi cho phản ứng RT-PCR/PCR đặt của hãng Sigma-Mỹ, enzym giới hạn: EcoRI và các enzym khác.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp thu nhận mẫu và xử lý bệnh phẩm virus cúm A/H5N1. - Phương pháp tách RNA tổng số, phương pháp thực hiện RT-PCR - Phương pháp dòng hoá sản phẩm trong vector tách dòng.
Tách chiết RNA tổng số
Chuyển cDNA
Dòng hoá trực tiếp vào vector pCR®2.1 Thực hiện phản ứng PCR
Tách chiết DNA của plasmid (plasmid tái tổ hợp dương)
Giải trình tự Chuỗi DNA (đã xử lý) Tìm kiếm/ so sánh/tìm cấu trúc gen
Chuỗi DNA sản phẩm cuối cùng
Phân tích xử lý chuỗi gen
So sánh đối chiếu Lập phả hệ
- Phương pháp giải trình trình tự và truy cập Ngân hàng gen thu nhận chuỗi gen, phương pháp phân tích và xử lý chuỗi gen.
- Phương pháp so sánh đối chiếu kết quả bằng chương trinh tin-sinh học. - Phương pháp xác định hệ số tương đồng và nguồn gốc phả hệ
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số (genomic RNA)
Sử dụng Bộ QiaAmp Viral Mini Kit của Hãng QIAGEN cung cấp. Kĩ thuật tách chiết được được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
RNA tổng số sau khi tách chiết được bảo quản trong lạnh ở -20oC hoặc -
70oC, và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR nhân bản đoạn gen cần
nghiên cứu với các cặp mồi đặc hiệu.
Hình 2.1. Sơ đồ các quá trình nghiên cứu phân tích 3 gen: gen NP, gen M, và gen NS virus