V. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
5.2. Các phương pháp chuyển gen
5.2.1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen ở thực vật. Phương pháp này dùng Ti- plasmid của A. tumefaciens hoặc Ri plasmid của A. rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plasmid gồm hai thành phần T -ADN và vùng vir (virulence). T-ADN cĩ thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà cĩ thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T -ADN để đưa vào tế bào. T -ADN chức gen điều hồ sinh trưởng cục bộ và gen tổng hợp các chất opine. Đoạn cuối cĩ 25 cặp bazơ lặp lại, bất kỳ đoạn nào trong vùng này cũng cĩ thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Vùng vir gồm sáu nhĩm từ virA đến virG trong đĩ virC và virE cĩ tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết là cắt bỏ các gen điều hồ sinh trưởng cục bộ sau đĩ gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển (promote) phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng là gắn gen cần biến nạp.
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thực hiện cĩ hiệu quả trên nhiều loại cây hai lá mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng và cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs, 1988; Dhir & cs, 1992), bơng (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngơ (Gould & cs, 1991; Citovsky & cs, 1994). Những thành cơng mới nhất trên lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) đã làm cho phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn và củng cố vị trí của nĩ như các nhà tiền bối hy vọng ngay từ đầu. Cho đến nay chuyển gen thơng qua Agrobacterium là phương pháp cho tần số biến nạp cao hơn và cĩ thể xác định được sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp chuyển gen nào (Chan & cs, 1993)
Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus là phương pháp gắn ADN virus vào T -ADN của Ti plasmid và chuyển vào tế bào thực vật. Khi vào tế bào thì ADN virus được giải phĩng để tạo virus hoạt động và xâm nhập vào genơm tế bào gần vùng u do
Agrobacterium gây nên. Bằng phương pháp này Grimsley và cs (1987) lần đầu tiên cho thấy khả năng chuyển gen ở cây ngũ cốc bằng Agrobacterium.
5.2.3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) là phương pháp chuyển ADN thơng qua xử lý polyethylen glycol (PEG). Đây là phương pháp chuyển gen cho hiệu quả cao. Bằng phương pháp này đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ (Potrykus & cs, 1985). Phương pháp này cĩ các ưu điểm như: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao; cĩ thể chuyển gen vào protoplast bất kỳ lồi cây nào. Tuy nhiên vấn đề tái sinh cây từ protoplast cịn khĩ khăn ở một số lồi cây. Mặc dù đã cĩ nhiều thành tựu trong nuơi cấy protoplast nhất là protoplast của các giống cây cĩ giá trị kinh tế như lúa, ngơ, luá mì, đại mạch ... nhưng phần lớn việc tách nuơi tế bào đều phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuơi cấy phơi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều này khơng phải dễ thực hiện đối với các giống cây trong sản xuất.
5.2.4. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen.
Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại (vàng hoặc vonfram) được bao bọc bởi ADN và bắn vào tế bào. Bằng phương pháp này cĩ thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Người ta hy vọng phương pháp này sẽ giải quyết tất cả các vấn đề chuyển gen, nhưng cho đến nay tần số biến nạp bằng phương pháp bắn gen cịn thấp và thường xuyên nhận được cây biến nạp khảm (cây cĩ các tế bào biến nạp và tế bào khơng được biến nạp). Cĩ thể nĩi đến một số ưu điểm của phương pháp bắn gen là:
- Thao tác dễ dàng.
- Bắn một lần được nhiều tế bào.
- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuơi cấy, các mơ).
Cây đậu tương biến nạp đầu tiên đã nhận được bằng phương pháp này (McCabe & cs, 1988). Nhiều phịng thí nghiệm đã nhận được cây ngơ biến nạp trong cùng thời gian (Fromm & cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990). Một vấn đề tồn tại quan trọng là tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus (1991) thì ưu điểm thực sự của phương pháp
bắn gen là ứng dụng trong nghiên cứu sự thể hiện tạm thời của gen. Nhưng trong những năm gần đây đã cĩ hàng loạt các cơng bố về biến nạp thành cơng trên lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía, bơng ... đã khẳng định những ưu việt của phương pháp này.
5.2.5. Phương pháp vi tiêm.
Phương pháp vi tiêm P (microinjection) vào hợp tử và phơi từ hạt phấn. Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đưa ADN vào những tế bào nhất định (Neuhaus & Spangenberg, 1990). Phương pháp này đã tạo được dịng biến nạp từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phơi phát triển từ hạt phấn ở cây cải dầu. Giống phương pháp bắn gen, vi tiêm cĩ thể đưa ADN vào những tế bào xác định cĩ thành xellulơ. Vi tiêm hạn chế hơn bắn gen ở chổ một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần khéo léo hơn. Vi tiêm cĩ một số ưu điểm sau:
- Cĩ thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào.
- Cĩ thể quyết định đưa ADN vào loại tế bào nào.
- Cĩ thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và cĩ thể quan sát đuợc. - Các tế bào cĩ cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phơi mặc dù hạn chế về số lượng cũng cĩ thể tiêm một cách chính xác.
- Cĩ thể thực hiện nuơi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm. - Cĩ thể biến nạp mọi giống cây .
Cho đến nay bằng các phương pháp kể trên đều đã nhận đuợc cây biến nạp. Ngồi ra một số phương pháp khác cũng được thực hiện nhưng chưa cĩ kết quả hoặc kết quả chưa khẳng định, đĩ là các phương pháp sau:
- Phương pháp ủ hạt khơ hoặc phơi trong dung dịch ADN.
- Phương pháp biến nạp thơng qua hạt phấn. Phương pháp này dựa vào cơ sở là ADN cĩ thể được xâm nhập vào hạt phấn ở giai đoạn nảy mầm và cĩ thể di chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987).
- Phương pháp đường dẫn ống phấn (Luo, 1988). Phương pháp này cũng tương tự như phương pháp biến nạp thơng qua hạt phấn là đưa ADN vào hợp tử bằng ống phấn.
- Phương pháp vĩ tiêm (macroinjection). Phương pháp này sử dụng kim tiêm cĩ đường kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa ADN vào tế bào, các tế bào này bị phá vỡ và ADN xâm nhập vào tế bào bị thương rồi sau đĩ được chuyển vào các tế bào bên cạnh
- Phương pháp xung điện (electropoation). trong phương pháp này, dùng hiện tuợng phĩng điện để tạo lỗ trên màng tế bào làm cho việc đưa ADN vào tế bào dễ dàng hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Đối với protoplast, phương pháp xung điện đã cĩ một số kết quả khích lệ (Fromm, 1987), nhưng chưa cĩ những chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa việc nuơi cấy protoplast ở một số lồi cây vẫn cịn gặp nhiều khĩ khăn.
- Ahokas (1989) đã sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mơ phân sinh chồi từ hạt đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mơ cĩ thể vận chuyển gen vào tế bào hay khơng. Kết quả tác giả nhận được sự thể hiện tạm thời của gen chỉ thị (GUS) nhưng khơng chứng minh được sự biến nạp ổn định.
- Liposom cĩ chứa ADN cũng đã được sử dụng như một phương tiện để đưa gen ngoại lai vào tế bào thơng qua dung hợp (Caboche, 1990) hoặc vi tiêm vào khơng bào (Lucas, 1990). Cả hai phương pháp này đều chưa thu đựợc kết quả.
- Phương pháp vi laser được ứng dụng để tạo lỗ hổng trên màng tế bào sau đĩ ủ tế bào với dung dịch ADN được Weber (1990) sử dụng như một phương pháp chuyển gen khơng cần vectơ, nhưng sau một thời gian dài vẫn chưa cĩ kết quả chắc chắn về sự xâm nhập của ADN vào tế bào (1995) Guo đã kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng trương để rút bớt nước từ tế bào sau đĩ chuyển vào mơi trường cĩ thế năng thẩm thấu yếu cĩ chứa ADN ngoại lai và dùng laser tạo lỗ trên màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào. Bằng phương pháp này các tác giả đã quan sát thấy sự thể hiện của gen biến nạp sau khi xử lý tế bào và ở cây tái sinh.