Mục đích của nghiên cứu là thiết kế vector có đầy đu các yếu tổ cần thiết để có thể biểu
hiện sen đích trong vi khuân B. s u b ti l is mà không cân sử dụng chât cảm ứng.
Nội dung nghiên cứu:
1. Vector dược thiết kế cần có các yếu tố như sau:
• Promotor: mạnh, hoạt động liên tục của B. s u b tilỉs đê gen được cài đặt có
thể biểu hiện mà không cần sử dụng chất cảm ứng (inducer)
• Vị trí bám của ribosome: vị trí bám tốt của gen biểu hiện mạnh trong vi
khuẩn B. s u b tilis
• Vị trí cat đa điểm: có vị trí cắt đa điểm của các enzym e giới hạn thương
phẩm phổ biến
• Vector thiết kế phải có đoạn tương đồng với nhiễm sắc thể của vi khuẩn B.
s u b tilis để có thể xảy ra trao đổi chéo kép giữa vector và nhiễm sắc thể của vi khuẩn
2. Sau đó vector thiết kế được sử dụng để biểu hiện gen đích irons vi khuẩn B. s u b tilis mà không cần chất cảm ứng.
t
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẠT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu đối tuọng nghiên cứu và hóa chất sử dụng
2 .1 .1 . N g u y ê n v ậ t l i ệ u đ ố i t ư ợ n g n g h i ê n c ứ u
Các chủng vi sinh vật và các cặp môi được sử dụng trong nẹhiên cứu lân lượt được liệt kê trong bảnc 1 và bảna 2.
B ủ n g 1. Các chủne vi sinh vật sử dụng trorm nghiên cứu
Tên chủng Nguồn gốc Đặc điểni
E. c o li D H 5a Thương phẩm Biến nạp, nhân dòng và biến đổi di truyền
B. s u b tilis PY79 Thương phẩm Dùng trong phòng thí nghiệm, để nhân dòng và biến đổi di truyền
pDG268 Thương phẩm (từ
B a c illu s Genetic Stock Center)
E. c o li D H 5a chửa vector pDG268 dùng
làm khuôn để khuếch đại gen la c Z
pƯLl Được tạo ra trong
nahiên cứu nàv
E. c o ỉì D H 5a chứa vector pƯLl mang
đoạn chèn PrrnO-RBS của gen s p o V G
pUL2 Đươc tao ra trone, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
t
nghiên cứu này
E. c o li D H 5a chứa vector pDG 364 mang
đoạn chèn PrrnO-RBS của gen s p o V G -
l a c Z
pl)L3
, ... ... -.... -
Đ ược tạo ra trong nghiên cứu này
Thể biến nạp của B. s u b tilis PY79 chứa
đoạn PrrnO-RBS của gen s p o V G - la c Z
được cài nhập tại locus a m y E trên nhiễm
pƯL4
■ ... — ...
Được tạo ra trong Thê biến nạp của B. s u b tilis PY79 chứa
nghiên cứu này đoạn PrrnO-RBS của gen s p o V G - la c Z
dược cài nhập tại locus a m v E trên nhiễm
sắc thể
B ả n g 2. Các cặp mồi sử dụng trone nghiên cứu
Tên mồi T rình tự m ồi (5 ’ - 3 ’) Vai trò của cặp mồi
P r r n O F agatctGCATGACCATTATGACTAG Nhân đoạn gen P r r n O từ vi khuẩn
D. s u b tilis (phân gạch chân là vị trí
B g l lỉ tại F và X b a ỉ tại R)
P r r n O R tctagaACAGGTTAAGTTCACCG CATCC
s p o V G F tctagaA A A G G TG G TA A RBS của gen s p o V G từ vi khuẩn B. s u b tilis (phần gạch chân là vị trí
X b a ì và N c o ỉ tại F và tại R tương ứng)
s p o V G R ccatggTTACC ACCTTT
L a c Z F CGCGGATCCG AAGTTACTG ACGT AA GATTACGGG
Nhân đoạn een la c Z từ vector
pD G 1664 (phần gạch chân là vị trí
B a m H \ và H in d ỉU tại F và tại R) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
L a c Z R G AG A A G C TTTTA T TTTTGACACCAG A CCAACTG G
1
P r r n O
F1
CCG G AATTCG CATG ACCATTATG AC TAG
Cùna với ỉa c Z R đê nhân dòng đoạn
PrrnO-RBS của s p o V G - la c Z (phần
gạch chân là vị trí £coR I)
r
2.1.2. Hóa chât và m ôi trư ờ n g
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu chuẩn chất lượne, cao của các hãng cune cấp lớn như Merck (Đ ức), Sigma (MỸ). Hoá
chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân từ do các hãng Bioneer (Hàn Quốc). Fermentas (Đ ức). Q iagen (M ỹ), BioRad (M ỹ), Roche cung cấp. Các cặp mồi được đặt từ hãng 1DT (M ỹ).
Môi trường LB cho nuôi cấy E. c o li DH 5a. môi trường DSM đế nuôi cấy các chuna B.
s u b tilỉs dược mua từ hãng D ifeo (U SA ). Thành phần các môi trường khác được trình bày chi tiết ờ phụ lục 1.
2 .1 .3 . T h iế t b ị, dụng c ụ s ử dụng t r o n g n g h i ê n c ứ u
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòna Công nghệ Enzyme-Protein, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà N ội. Các thiết bị sử dụng là các thiết bị chuyên môn dùng trong lĩnh vực vi sinh vật, sinh học phân tử và hoá sinh đạt tiêu chuẩn quốc tế.
2.2 Phưong pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình tách dòng
Quy trình tách dòng được thể hiện trong hình 3.
V
Kiếm tra gen đích chèn thêm (PCR khuẩn lạc và/hoặc cắt plasmid. sequence)
Ịnỉmth M ■ nTTTrmTTTnTTTĨTĩ
Đê khuếch đại gen đích, chúng tôi sư dụng phản ứng PCR. Điêu kiện tối ưu và các thành phần phản ứng PCR được trình bày trong bảns 3.
2 . 2 . 1 . 1 K h u ế c h d a i g e n d í c h
B ủ n g 3 . Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thề tích
Oil)
Đ iều kiện
Khuôn thích hợp cho mỗi phản ứna 3 Biến tính: 94°c trong 2
phút 94°c trong 30 giây Gắn mồi: 5 0 -55°c trong 30 giây Tổng hợp: 72°c trong 30 giây - 3 phút 30 giây Chu trình lặp lại 30 lần h2o 16 Dung dịch đệm 10X (20 mM M g2*) 2,5 dNTPs (2 niM ) 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi xuôi (10 |iM ) 0,5
Mồi ngược (10 fiM ) 0,5
Taq D N A polym erase có tính chất
đọc sửa (1 U /ịiI)
0,5
2.2.1.2 Thành phần phàn ứng dê cất D N A với các enzym e giới han và nối gen đích với ị
vector
Thành phần phản ứng D N A được xử lý với các enzym e giới hạn được liệt kê trong bảng
B ả n g 4. T h à n h p h ầ n p h ả n ứ n g x ử lý v ớ i e n z y m e g i ớ i h ạ n [ 4 2 ] Thành phần phản ứng The tích (jil) h20 21 Dung dịch đệm 10 Enzym e giới hạn 1 1 E nzym e giới hạn 2 ] D N A đích 17
Hồn họp phản ứng cắt dược trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp với từng loại enzym e. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose với các nồng độ thích hợp và sau đó D N A đích được thu nhận bàna phương pháp tinh chế qua bộ kit QIAGEN. Quy trình tinh chế được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi xử lý bang enzym e giới hạn thích hợp. D N A đích và vector được nối với nhau bang T4 ligase. Thành phần phản ứng nối dược thể hiện troim bảng 5.
B ả n g 5. Thành phần phản ứng nối [42] Thành phần phản úng Thể tích (fil) h20 5 Dung dịch đệm 2 Enzym e T4 D N A ligase 1 D N A đích + vector 12
Hỗn hợp phản ứ ns nối được thực hiện ở 16°c trona 16h - 18h, được biến nạp vào tế bào
khả biển của E. c o li DH5cx và trải trên môi trường LB chứa kháng sinh thích hợp
2.2.1.3 B iên nap vào tê hào kha biên cua E. c o li DH5u và B . s u b til is
2.2 .1 . S. I T á ch c h iê i p la s m id , c lìu â n b i tẽ b à o k h a b iê n c u a E. c o li D H 5 a và b iê n n a p p l a s m id veto v i k h u â n n à y
Tách chiết plasmid được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Sambrook và cộng sự [35] hoặc được thực hiện theo đúng hướng dẫn của hãng Roche và Bioneer. Chuân bị tế
bào khả biến của E. c o l i D H 5a và biến nạp plasmid vào vi khuân này cũng được thực
hiện theo phương pháp m ô tả bởi Sambrook và cộng sự [35].
2 .2 .1 .3 .2 P h ư ơ n g p h á p ta o lè b à o k h ả b iế n B. s u b tilis v à b iế n n a p D N A v à o tê b à o n à v
Các phương pháp này được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Cuttine và cộng sự
[14]. Vắn tất là, B. s u b ti l is PY 79 dược nuôi đến pha bão hòa trong môi trường SpC và
sau đó được nuôi tiếp trong môi trườne Spli. Sau đó glycerol dược bổ sung để đạt đến
nồng độ cuối cùrie, là 10% và tế bào được chia vào các ổng (200 Ịil/ống), giữ ở -80°c đến
khi sử dụng. D N A sau khi bổ sung vào tế bào khả biến của B. s u b tilis đã được làm rã
đông, được lắc tại 37°c trong 30-45 phút và được trải trên các đĩa chứa môi trường kháng
sinh sàng lọc thích hợp.
2.2 . ] .4 P h ư ơng pháp k iê m tra gen đích chèn thêm
2 .2 .1 .4 .1 P C R k h u ẩ n lạ c
Sau biến nạp. các thể biến nạp sẽ được trải trẻn môi trường nuôi cấy chứa kháng sinh thích hợp. Dùng đầu tăm vô trùna chấm lên các khuẩn lạc m ọc riêng rẽ trên đĩa môi
trường, chuyển vào ống PCR đã bổ sung 10 pl nước M iliQ và ủ ở 95°c trong 5 phút để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phá vỡ thành tế bào. Sau đó, các ống này được bổ sung thêm 15.0 ^1 hồn hợp gồm các thành phần được trình bày trona bảne 6.
B áng 6. T h à n h p h â n p h ả n ứ n g P C R k h u â n l ạ c , Thành phân phản ứng Thể tích Nước 9.5 Đệm 10X 2.5 dNTPs (2 mM) 2.0
Mồi xuôi (10 |iM ) 0.25
M ồi ngược (10 ịiM ) 0.25
T a q D N A polym erase (1 u /|il)
t
0.5
2.2. ỉ. 4 .2 Đ iê n d i
Điện di được thực hiện trên agarose với các none độ 1% hoặc 1.5% tương ứng với kích thước đoạn D N A . Mầu có thể tích thích hợp được trộn với đệm mẫu và nhỏ vào các giếng. Đệm chạy điện di là TAE (Tris-acetate-EDTA,). Điều kiện chạy điện di là 100 V trong các thời gian thích hợp. Sau đó bản gen được nhuộm với ethidium bromide, soi và chụp ảnh trên máy Gel Doc.
2.2.2. Phương p h á p kiếm tra sự cài nhập và đánh giá hoạt tính gen lacZ trong vi khuẩn B. su b til is
2.2.2.1 Phương pháp kiêm tra sư cải nhâp gen la c Z
Vector pDG 364 có chứa gen đích (la c Z ) sẽ được duỗi thẳng bàng cách sử dụng enzym e
giới hạn mà không ảnh hường đến cassette cài nhập [41]. Gen ! a c Z sẽ được cài nhập theo
phương pháp trao đổi chéo kép giữa gen o m y E của vector pD G 364 (chứa hai phần của
gen o m v E , và sen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase giữa chúng, hình 4) và gen a m y E trên nhiễm sác thể của vi khuẩn B. s u b tilis nên thể tái tổ hợp mang aen la c Z cài nhập sẽ được kiểm tra theo hai tiêu chí:
• K iế m tra k h a n ă n g k h ả n g k h á n g s in h c h lo r a m p h e n ic o l'. Sàne lọc các thê biên nạp trên môi trường có bổ sung chloramphenicol (50 (!g/'ml) để lựa chọn thể tái tổ hợp
• K iế m tra h o ạ i tín h a m y la s e : D o trao đổi chéo kép. gen a m v E bị mất tính ngyên vẹn dẫn đến mất hoại tính am ylase. D o đó. thể tái tổ hợp khône có khả năng phân aiải tinh bột. N hò dịch nuôi các thể biến nạp trên đĩa thạch đục iỗ có bổ sung tinh bột (0.1%), ủ
37°c trons 8h. nhuộm đĩa bàng dunạ dịch lugol và các thể biến nạp không có khả năng phân giải tinh bột (không có vòng sáng trên đĩa) sẽ được lựa chọn.
Pstl Pstl ; \ ; nhiêm sác thế u m y l ' 1 B subtihs ^7<ỳ E 3
H ìn li 4. Cài nhập gen l a c Z theo phươns pháp trao đổi chéo kép vào nhiễm sắc thể của vi
khuẩn B. s u b tiỉis
2 . 2 2 . 2 Phương pháp dánh giá hoat tinh gen la c Z trong vi khuẩn B. s u b tilis
Hoạt độ P-galactosidase được xác định bằng cách cho enzym e này phản ứng với cơ chất tông hợp o-nitrophenvl-P-D-aalactopyranosiđe (ONPG). Dưới tác dụng của P- galactosidase, ONPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. o-nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và bị hấp thụ ở bước sóng 420nm . Một đơn vị hoạt độ (U ) P-galactosidase là lượng enzym e cần thiết để giải phóng 1 ịimol
o-nitrophenol trong 1 phút ở 30°c theo điều kiện thí nghiệm.
T r o n g đ ó :
O D420 * 1000
1 đơn vị (U) = ---
(Thời gian) * (Thề tích) * (ODéoo)
O D4 2 0: O D c ủ a p h ả n ứ n g m à u đ o đ ư ợ c tạ i 4 2 0 nrn T h ờ i g i a n : T h ờ i g i a n p h à n ứ n g (p h ú t)
T h ể tíc h : T h ê tíc h d ịc h n u ô i c â y iron's, p h ả n ứ n g (m l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
' C H Ư Ơ N G III. K ÉT Q U Ả VÀ T H Ả O LU Ậ N
3.1 T hiêt kc v ecto r biêu hiện gen trong vi khuân B . s u b tilỉs
D o tính thuận tiện của l a c Z (tính dễ nhận biết và các phương pháp xác định hoạt độ aen
này trong vi khuẩn là đã biết), chúng tôi lựa chọn gen la c Z làm mô hình để biêu hiện
trong B. s u b ti l is khi sử dụng vector biểu hiện được thiết kế trong nehiên cứu. Mặt khác
chúng tôi muốn tận dụng các vị trí enzyme giới hạn có trons, gen la c Z đe bổ suna thêm
các vị trí cat đa điểm trong vector thiết kế. Dựa trên cấu trúc của các vector thương phẩm pET 28b (promoter, R BS. đuôi His (6 Histidine) sau mã mở đầu, vị trí cắt đa điểm, gen mã hóa kháng kanam ycin), đặc điểm của vector pD G 364 (3 vị trí cắt đa điểm lần lượt là
£cơRJ, H i n ă l \ \ và và đặc điểm nổi bật của pBlucscript (gen ỉa c Z chứa vị trí cắt
đa diêm), quy trình thiết kế vector biểu hiện gen trong vi khuấn B. s u b tilis được chúng tôi
thực hiện theo sơ đồ như hình 5.
C h r o m o s o m e c u a fí subtỉìis P Y 7 9 ! ' ! n ‘ u ỉ ! ! n H ; » H ; ; ¡ i t H ! . i * : r . , . ! ; ‘ • ■ ; / i i t i : M Ỉ - ■ • .
ỊỊ PCR (PrrnO F và PrrnO R
3.1.1. Tách dòng đoạn DNA, bao gồm prom oter của rRNA và RBS cua gen spoVG cua Bacillus subrilis trong vector p E T 28b đế tạo ra vector pU L Ỉ
Tổne hợp rRNA được kiểm soát chặt chẽ bởi điều kiện dinh dưỡne trorm môi trường nuôi
cấy và được điều khiển bời promoter rr n . B. s u b tilỉs chứa 10 operon r r n , 6 trons, số đó có
đồng thời ca trình tự promoter P1-P2 và 4 operon chỉ chứa một trong hai dạng trình tự
trên. Đối với B. s u b tilis , theo các tài liệu công bố, độ mạnh của promoter r r n phụ thuộc
chủ yếu vào hai box tại vị trí -10 và -35 trong mỗi promoter. Operon r r n O là một trone, số
6 operon chứa done thời cả trình tự promoter P1-P2 và biểu hiện của gen dưới sự điều
khiên của promoter này là mạnh nhất trong số các operon r r n [25].
Trình tự tại vị trí -35 và -10 (phần gạch chân) của hai promoter P1 và P2 được thể hiện dưới đây [25]:
P l : ...Mflcflgtcataaaaatta/ggfrf/fl<ư. ■. ■
P2 :...//¿flççtagttaactaaaaaj&t/gçta/....
Do gen hoạt đ ộ n s dưới sự điều khiển của r r n O P2 biểu hiện ổn định và ít bị ảnh hưởng
bởi điều kiện dinh dưỡng của môi trường hơn so với r r n O P1 [25], nên chúng tôi quyết
định chọn trình tự r r n O P2 để làm trình tự promoter trong vector thiết kế và từ đây chúng
tôi sẽ ký hiệu là PrrnO. Chúng tỏi đã sử dụng mồi với các đầu dính B g lII tại F và X b a l tại
R để khuếch đại trinh tự đoạn PrrnO từ D N A genom e của B. s u b tilis PY79. Điều kiện
phản ứng PCR được trình bày trong bảne 3 phần Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.
Ket quả là chúng tôi đã thu được một băng duy nhất vé'i kích thước 244 bp, chứa cả vùng -10 và -35 của PrrnO. Ket quả được thể hiện trong hình 6. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M PrrnO (-") 1 . , .... 1 ; Ề W-h ũ' í £■ J 1...' i 244 bp 1 — 1 g í
H ìn h 6. Kết quả khuếch đại đoạn PưnO từ genom e của B. s u b tilis
M: Gene Ruler Express DNA Ladder; PrrnO: đoạn DNA PrrnO; (—): Đối chứng âm
Trình tự RBS của gen s p o V G trong B. s u b tilis được tổng hợp nhân tạo bằng cách nối hai
đoạn oligon ucleotid e (oligonucleotide xuôi: tctagaAAAG G TG G TAA và oligonucleotide
ngược: ccatggTTA C C A C C TTT). Đoạn này được thiết kế với các đầu dính X b u \ and N c o \
tại đầu 5' và 3' tương ứng. Đ oạn D N A sản phẩm PCR mã hoá cho pr r n O promoter (được
cắt với B g l \ \ và X b a \ ) cùng với RBS của gen s p o V G (cũng đã được cắt với X b a ỉ và N c o ỉ),
được nhân dòng trong plasmid pET 28b đã được xử lý bằng hai enzym e B g ỉII và N c o \.
Sản phấm nối được biến nạp vào E. c o li và các thể biến nạp được sàng lọc băng cách sử
1 (+) 2 3 4 5 (-) 6 ỈM
H ìn h 7.PCR khuẩn lạc chứa PrrnO
1. 2, 3, 4, 5, 6: PCR khuẩn lạc chứa PrrnO; (-): đối chứng âm; (+): sản phẩm PCR khuếch đại
PrrnO từ chromosome cùa B. su b tilis PY79; M: DNA marker 100 bp
Kết quả hình trên cho thấy, sản phẩm PCR các khuẩn lạc số 2, 3, 4, 5 cho một băng kích
thước đủng như băng sàn phẩm PrrnO khi dược khuếch đại từ chrom osom e của B. s u b tilis
PY79. Sau đó, chúníì tôi sử dụng khuẩn lạc sổ 5 để nuôi cấy tách chiết plasmid và
plasmid này được ký hiệu là p U L l. pU L l được gửi xác định trình tự PrrnO và RBS của
s p o V G (đoạn này được xác định trinh tự trong pUL2) và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. N hư vậy promoter T7 và RBS trên vector thương phẩm pET28b lần lượt được thay