1.3.3.1. Sinh dưỡng của nấm men
Cấu tạo của tế bào nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm:
Nước: 75 – 85%.
Chất khô: 15 – 25%. Trong đó chất khoáng chiếm 2 – 14% hàm lượng chất khô.
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của nấm men Các chất Thành phần (% chất khô) Cacbon CaO Nitro Hydro P2O5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO 49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09
(Nguồn: Lượng, Nguyễn Đức, 1996)
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê,…
- Dinh dưỡng Cacbon:
Nguồn Cacbon cung cấp là: các loại đường: saccarose, maltose, lactose, glucose…và dẫn xuất; các loại rượu; acid hữu cơ; acid amin; pectin; hydratcacbon và v.v…
- Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch.
- Dinh dưỡng Nitơ:
Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là: acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là: các muối amon khử nitrat, sulfat…
- Các vitamin và chất khoáng:
Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men:
Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn.
Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme.
Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men.
Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men,
tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic.
Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
1.3.3.2. Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men
Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản:
Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này.
Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa. Permeaza là một protid hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp.
1.3.3.3. Quá trình sinh trưởng và phát triển
- Sự sinh trưởng:
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều.
- Sự phát triển:
Saccharomyces sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát
hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra
chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian. Trong quá trình phát triển hình thái của nấm men thay đổi như sau:
Nấm men trẻ (sau 12 - 16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, căng, nguyên sinh chất đồng nhất, không bào chưa có hoặc chỉ mới bắt đầu phát triển.
Nấm men trưởng thành (sau 24 - 48 giờ nuôi cấy): kích thước điển hình, không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glucogen tăng, tế bào sinh sản chiếm 10% - 15%.
Nấm men già (sau 72 giờ nuôi cấy hoặc kéo dài hơn): màng dày nhẵn, nguyên sinh chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng nhanh, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glucogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ cao.
Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:
Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch.
Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào…
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai đoạn:
t Hình 1.7: Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men
Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều.
Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men.
Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.
Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết.
Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng tế bào nấm men giảm dần.
1.3.4. Các hình thức hô hấp của nấm men
Ở nấm men, hô hấp là quá trình hô hấp khá phức tạp, nó xảy ra theo hai chiều hướng khác nhau. Vì thế người ta phân thành 2 loại hô hấp: hô hấp hiếu khí và hô hấp kị khí.
Hô hấp hiếu khí:
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 674 cal. Hô hấp kị khí
C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal.
I.4. Sự lên men rượu
I.4.1. Cơ chế của quá trình lên men rượu
Lên men là quá trình trao đổi chất các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là đường sẽ được chuyển hóa dưới tác dụng enzyme của vi sinh vật tạo thành các chất đơn giản hơn và giải phóng năng lượng cung cấp cho cơ thể vi sinh vật. Các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men là phản ứng tách và vận chuyển hydro dưới dạng H+, +e dưới tác dụng của enzyme. Trong quá trình đó hydro được tách ra khỏi cơ chất chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Đối với quá trình lên men rượu thì sản phẩm cuối cùng là ethanol.
Phương trình đơn giản :
C6H12O6 C2H5OH + CO2 (sản phẩm đầu) (sản phẩm cuối)
Đây là phương trình đơn giản chỉ chỉ ra sản phẩm đầu của quá trình lên men là đường glucose và sản phẩm cuối là rượu ethanol và cacbonic. Thực chất quá trình lên men là trao đổi chất rất phức tạp qua 13 giai đoạn sau:
Glucose Hexokinaza Glucose – 6 – phosphat Photphoglucoza isomeraza Fructose – 6 – phosphat PhosphoFructokinaza Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza
Glyceraldehyd-3-phosphat Dihydro aceton phosphat Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinaza Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerat-mutaza Acid – 2 – phosphoglyceric Enoiaza Acid phosphoenolpyruvic Pyruvat kinaza Acid – enol – pyruvic
Acid pyruvic
Pyruvate – decarboxylaza Ethanal
Aldodeshydrogenaza Ethanol
1) Dưới tác dụng của hexokinaza, glucoza được chuyển thành glucoza-6- photphat. Phương trình phản ứng: CHO CHO CHOH CHOH OH-CH OH-CH hexokinaza CHOH + ATP CHOH
CHOH CHOH
CH2OH CH2OP Glucoza Glucoza-6-photphat
2) Glucoza-6-photphat sẽ chuyển đồng phân thành frutoza-6-photphat dưới tác dụng của enzyme isomeraza. Phản ứng thuận nghịch nhưng dịch chuyển về hướng frutoza-6-photphat. Phương trình phản ứng: CH2OP Fructoza-6-photphat C=O OHCH CHOH CHOH CH2OH photphoglucoisomeraza OHCH CHOH CHOH CHO CHO CH2OP CHO Glucoza-6-photphat
3) Fructoza-6-photphat dưới tác dụng của phospho fructokinaza sẽ chuyển đồng phân thành fructoza-1,6-diphotphat. Phương trình phản ứng: Phospho fructokinaza Fructoza-6-photphat Fructoza-1,6-diphotphat 4) Fructoza-1,6-diphotphat chứa hai gốc photphat ở 2 vị trí đối xứng nhau nên dễ dàng bị cắt thành hai phân tử triosephotphat là: 3-photphodioxy acetone và 3-photpho glyxealdehyt. Phản ứng này là thuận nghịch.
Phương trình phản ứng: Aldolaze CH2OP CH2OH OHCH CH2OP C=O CHOH CHOH CH2OP C=O CH2OP CHO CHOH 3-photphodioxy 3-photpho aceton glyxealdehyt Fructoza-1,6-diphotphat C=O OHCH CHOH CHOH CH2OH CH2OP C=O OHCH CHOH CHOH CH2OP CH2OP
5) Hai chất 3-photphodioxy aceton, 3-photpho glyxealdehyt hình thành có thể chuyển hóa cho nhau dưới tác dụng của enzyme triose photphatisomeraza
Phương trình phản ứng:
triose photphatisomeraza
3 photphodioxy aceton 3 photpho-glyxealdehyt
6) Sau giai đoạn này là quá trình oxy hóa khử và chỉ có aldehyt glixerinic, enzyme xúc tác cho quá trình này tách ra từ nấm men và từ cơ chất.
Phương trình phản ứng:
NAD +H3PO4
Glyxerinal aldehyt
3 photpho dehyrogenase Acid 1,3-diphotpho glyxerinic 7) Từ 1,3-diphotpho glyxerinic xảy ra sự chuyển hóa gốc photphat cao năng sang phân tử ADP dưới tác dụng của photphoglyxeratkinaza.
Phương trình phản ứng:
photphoglyxeratkinaza
Acid 1,3 diphotphoglyxerinic Acid 3 photphoglyxerinic CH2OP C=O CH2OH C=O CH2OP C=O CHO CHOH CH2OP C=O CHO CHOH CH2OP C=O O-P C=O CHOH CH2OP C=O O-P C=O CHOH COOH C=O CH2OP CHOH
8) Sau đó, xảy ra sự chuyển hóa acid 3-photphoglyxerinic thành 2- photphoglyxerinic nhờ photphoglyxeratmutaza.
Phương trình phản ứng:
photphoglyxeratmutaza
9) Acid 2-photphoglyxerinic bị loại đi một phân tử nước dưới tác dụng của enzyme enolaza chuyển thành acid photpho enol pyruvic.
Phương trình phản ứng:
enolaza + H2O
Acid 2-photpho glyxerinic Acid photpho enol pyruvic
10) Acid photpho enol pyruvic loại gốc photphat sang phân tử ADN và tạo thành acid pyruvic và phân tử ATP.
Phương trình phản ứng: + ADP + ATP COOH C=O CH2OP CHOH COOH C=O CH2OH CHOP
Acid 3-photphoglyxerinic Acid 2-photphoglyxerinic
COOH C=O CH2OH CHOP CH2 C=O COOH COP || CH2 COOH COP || CH3 C=O COOH Acid photpho enol pyruvic Acid pyruvic
11) Acid pyruvic trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của enzyme decacbboxydaza, hoạt hóa bởi Mg++ sẽ chuyển thành aldehyt.
Phương trình phản ứng:
+ +
12) Khi axetaldehyt tạo thành chưa đủ thì enzyme alcoldehyrogenaza sẽ chuyển hydro đến aldehyde photphaglyxerinic. Dưới tác dụng của enzyme photphataza, photphoglyxerin bị phân hủy thành glyxerin.
Phương trình phản ứng:
13) Đến lúc axetaldehyt tạo ra đủ nhiều, enzyme sẽ chuyển hydro đến cơ chất và rượu etylic được tạo thành.
Phương trình phản ứng:
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + 2ADP + 3H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + H2O. Nấm men là cơ thể kỵ khí tùy tiện. Chúng hô hấp như những cơ thể hiếu khí bậc cao. Khi nấm men được gieo cấy vào môi trường có oxy hòa tan chúng hô hấp và sinh trưởng, tăng sinh khối. Lượng oxy hòa tan trong môi trường dần cạn kiệt, nấm men chuyển dần sang hô hấp kỵ khí hay lên men. Trong lên men rượu, các đường đơn như: glucoza và fructoza sẽ được phân giải theo con đường EMP và chu trình ATC trong giai đoạn đầu, tiếp theo là chuỗi hô hấp hoạt động giải phóng ra
CH3COCOOH CH3CHO CO2
Mg++ Decacboxydaza
Acid pyruvic Axetaldehyt
CH3CHO CH3CH2OH NADH + H+ acoldehyrogenaza rượu etylic CH2OP C=O CHO CHOH + ADP photphataza CH2OH C=O CH2OH CHOH + ATP glyxerin photphoglyxerin
nhiều năng lượng tích tụ trong ATP, sinh khối men giống tăng và khi môi trường chuyển sang kỵ khí (hết oxy hòa tan hoặc không cung cáp không khí) nấm men chuyển sang lên men, tích tụ rượu ethylic và CO2 (những sản phẩm chính) cùng một số sản phẩm phụ.
I.4.2. Giống
Để lên men rượu vang, người ta có thể sử dụng hai nguồn giống sau:
I.4.2.1.Nguồn giống đã được chuẩn bị sẵn dưới các dạng sau:
Từ men giống (ống giống thuần chủng):
Nấm men được giữ giống trên môi trường thạch, thuộc loại Saccharomyces ellipsoides hoặc S.cerevisiae. Giống men được cấy chuyền vào môi trường lỏng là dịch quả để tăng sinh khối, đủ lượng giống đưa vào sản xuất. Nước cái men sau nhân giống được cho vào môi trường lên men với tỷ lệ 3 – 10 % so với môi trường nước quả để lên men. Nếu lên men yếu phải bổ sung thêm.
Dùng ống men giống có ưu điểm là chủng men thuần nên chất lượng lên men cao, khả năng lên men nhanh. Tuy nhiên cũng có những khó khăn việc chế tạo nước cái men khá phức tạp, với cơ sở sản xuất nhỏ khó thực hiện. Sau khi nước cái men nhân giống xong phải tiến hành lên men ngay nếu không men sẽ già dẫn đến năng lực lên men kém.
Sử dụng bánh men cổ truyền:
Tiêu chuẩn phải đạt bánh men loại tốt, không có mùi lạ, bánh men phải còn trong thời hạn sử dụng, chưa có hiện tượng hư hỏng.
Bánh men bổ sung vào dịch quả lên men theo tỷ lệ 15-20 gam/lít dịch quả lên men. Trước khi bổ sung, bánh men phải được bóp vụn (Không được xay nghiền quá mạnh), sau đó đem rây để tách các tạp chất lớn.
Ưu điểm chính của việc sử dụng bánh men là đơn giản dễ thao tác, phù hợp với sản xuất nhỏ, nhưng nhược điểm chính là thời gian lên men dài, nếu sản xuất lượng lớn thì gặp khó khăn về khối lượng nấm men sử dụng.
Lên men tạo nguồn men giống cho các mẻ lên men sau:
Dịch lên men đang ở giai đoạn lên men mạnh, trong đó có nhiều tế bào nấm men đang hoạt động mạnh bổ sung vào nước quả định lên men, tỉ lệ 1/3 – 1/5 thể tích nồi lên men (lấy từ lần lên men trước).
Tuy nhiên cần lưu ý các điểm sau đây:
Thời điểm lấy nước cái men của mẻ lên men trước cần xác định sao cho đang ở giai đoạn sinh khối mạnh mẽ và ở đầu thời kỳ cân bằng, ổn định các tế bào nấm men là tốt nhất, vì ở thời kỳ này nấm men đã quen với môi trường và sinh trưởng tối đa, ổn định và chuẩn bị chuyển sang chế độ lên men mạnh mẽ, dịch lên men lúc này có nhiều tế bào nấm men. Theo kinh nghiệm người ta thường lấy vào thời điểm sau khi mẻ lên men được khoảng từ 12 – 36 giờ.
Vị trí lấy dịch cái men thường ở đáy thiết bị lên men, ở đó là chỗ nấm men tập trung nhiều hơn.
I.4.2.2. Dùng nấm men dính trên vỏ quả sau khi thu hoạch để lên men. Quả thu
hái về, giữ sạch sẽ, không rửa, ép lấy dịch. Dịch quả sẽ chứa một số lượng nấm men nhất định đủ để thực hiện quá trình lên men rượu.
Tuy nhiên, phương pháp này thường cho độ rượu thấp, dễ bị tạp nhiễm. Do nhiều vi sinh vật tham gia chuyển hóa đường nên sản phẩm sau lên men không thuần khiết, có nhiều sản phẩm phụ ảnh hưởng đến chất lượng thơm ngon của rượu thành phẩm. Để khắc phục nhược điểm của phương pháp này, trước khi lên men cần sunfit hóa dịch quả để diệt men dại, nấm mốc và các tạp khuẩn khác.
Trong lên men công nghiệp, để ổn định quá trình lên men, người ta phải sử dụng chủng nấm men thuần khiết được nuôi cấy nhân giống qua các cấp, cấy vào dịch lên men.
I.4.3. Lên men
I.4.3.1. Các giai đoạn lên men rượu vang
* Giai đoạn hình thành rượu: Là giai đoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Nếu giữ được nhiệt độ ổn định, thời
gian lên men này kéo dài từ 4 – 5 ngày. Kết quả của giai đoạn này người ta gọi là “rượu non”.
Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu ( đường, đạm, vitamin) mạnh, biến đường thành rượu, giải phóng CO2. Kết thúc giai đoạn này thành phần nước quả thay đổi rất lớn.
* Giai đoạn phát triển: Khi kết thúc lên men ở giai đoạn một, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng biện pháp lọc (đối với vang đỏ - vang thu được do lên men dịch quả có kèm xác quả). Trong cơ sở lên men ở quy mô lớn người ta dùng hệ thống ống hút xiphông để hút dịch lên men sang nồi hay bể lên men khác. Đây là lần gạn thứ nhất.
Khi được “rượu non”, ta tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai đoạn này quá trình lên men xảy ra không ồ ạt - người ta gọi là lên men phụ - phân hủy những gam đường cuối cùng có trong dịch lên men. Đồng thời ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic. Kết quả quá trình này, acid malic được chuyển thành acid lactic,