Để nhận dạng cỏc hợp chất hữu cơ, cỏc nhúm chức được đặc biệt lưu ý do sự tương tỏc của cỏc nhúm chức khỏc nhau với cỏc tia bức xạ. Nhờ sự hấp thụ cỏc bức xạ này trong cỏc vựng xỏc định mà cỏc phương phỏp vật lý dựng để xỏc định cấu trỳc phõn tử hữu cơ đó xuất hiện. Cỏc phương phỏp phổ này nhanh chúng được ỏp dụng rộng rói và đó trở thành cỏc phương phỏp khụng thể thiếu trong việc minh chứng cỏc hợp chất hữu cơ. Cỏc phương phỏp hiện nay đang được sử dụng nhiều như IR, X-ray, UV, NMR 1 chiều, NMR 2 chiều...
Phương phỏp cho kết quả định tớnh nhanh nhất về sự cú mặt của cỏc nhúm chức trong hợp chất hữu cơ cần khảo sỏt là phương phỏp phổ IR, phương
phỏp này dựa trờn nguyờn tắc sự tương tỏc của hợp chất hữu cơ (cụ thể là cỏc nhúm chức) với cỏc bức xạ trong vựng hồng ngoại. Phõn tử cú chứa cỏc nhúm chức khi hấp thụ cỏc bức xạ này bị dao động, cỏc dao động này bao gồm hai dao động cơ bản là dao động biến dạng và dao động hoỏ trị. Dao động biến dạng của cỏc nhúm chức, cụ thể là cỏc liờn kết giữa cỏc nguyờn tử của nhúm chức làm cho gúc liờn kết giữa chỳng bị thay đổi, sự thay đổi này được thể hiện qua cỏc tớn hiệu dao động mà cỏc tớn hiệu này được chuyển đổi thành cỏc tớn hiệu trờn phổ đồ. Trong dao động hoỏ trị, gúc liờn kết giữa cỏc phõn tử tuy khụng bị biến đổi nhưng độ dài cỏc liờn kết này lại bị thay đổi. Sự thay đổi này cũng dễ dàng được chuyển thành tớn hiệu phổ nhờ bộ phận khuyếch đại và chuyển đổi. So với cỏc dao động biến dạng, cỏc dao động hoỏ trị của một nhúm chức thường xuất hiện ở một vị trớ λ nhỏ hơn hay số súng lớn hơn. Chẳng hạn dao động biến dạng của cỏc liờn kết –N-H trong –NH2 thường xuất hiện như là một vạch sắc nột ở vựng 1000-1630 cm-1 . Trong khi đú tớn hiệu của dao động hoỏ trị của cỏc liờn kết này lại xuất hiện ở vựng 3400 – 3450 cm-1.
Áp dụng phương phỏp này cho hợp chất artemisinin phõn lập được từ cõy
Artemisia annua Việt Nam, kết quả cú cỏc dải dao động ứng với cỏc nhúm sau:
Phổ hồng ngoại của artemisinin (hỡnh 9, phụ lục 2) cú cỏc đặc trưng sau, dải từ 2800-2979 cm-1 là dao động hoỏ trị của liờn kết C-H, dải 1737 cm-1 của nhúm C = O, cỏc dải từ 1300 cm-1 → 1500 cm-1 của cỏc nhúm = CH2, - CH3 . Cỏc dải từ 1000 → 1200 cm-1 được xem như của cỏc liờn kết C - O – C. Ngoài ra cỏc dao động biến dạng của cỏc liờn kết C-H cũng xuất hiện từ 700-900 cm-1
Hỡnh 9: Phổ hồng ngoại của artemisinin 3.2.2. Kết quả xỏc định artemisinin bằng phổ NMR. 3.2.2.1. Phổ H-NMR.1
So với phương phỏp phổ IR, phương phỏp phổ 1H-NMR thường cho những thụng tin chi tiết và chớnh xỏc hơn về cấu trỳc của cỏc hợp chất cần xỏc định. Nguyờn lý của phương phỏp này dựa trờn sự tương tỏc của từ trường ngoài với cỏc proton cú trong phõn tử cỏc hợp chất hữu cơ. Cỏc tớn hiệu này sẽ được chuyển đổi thành cỏc tớn hiệu ghi được trờn phổ đồ. Trong cỏc phõn tử hợp chất hữu cơ, cỏc proton thường gắn với cỏc nguyờn tố khỏc nhau trong cỏc nhúm chức khỏc nhau, do sự chờnh lệch về độ õm điện giữa cỏc nguyờn tử này với cỏc nguyờn tử hidro mà lớp electron bao quanh proton sẽ bị kộo về cỏc nguyờn tử này. Tựy thuộc vào nguyờn tố mà proton này liờn kết mà lớp electron che phủ proton cũng khụng giống nhau do đú từ trường để cho cỏc proton này cộng hưởng cũng cú giỏ trị khụng giống nhau. Giỏ trị từ trường để cho mỗi proton này cộng hưởng sẽ quyết định vị trớ tớn hiệu cộng hưởng của proton đú, trờn phổ 1H-NMR (độ chuyển dịch hoỏ học). Cỏc proton tương đương nhau về từ (cỏc proton giống nhau) sẽ cho tớn hiệu cộng hưởng ở cựng một vị trớ.
Phổ 1H-NMR của artemisinin [hỡnh 10, phụ lục 3]được ghi tại 500 MHz cho thấy cỏc tớn hiệu cộng hưởng của cỏc proton khỏc nhau trong phõn tử artemisinin.
Hỡnh 10: Phổ 1H-NMR của artemisinin
Kết quả xỏc định cỏc proton trong phõn tử artemisinin được đưa ra ở bảng sau:
Bảng 1: Cỏc dự liệu cấu trỳc phổ 1H-NMR của artemisinin
Proton δ (ppm) J (H2) Proton δ (ppm) J (H2) 3H14 3H13 3H15 H5 H1 2H2 (a,b) H3 (a,b) d: 1,15 d: 1,2 S: 1,4 S: 5,8 m: 1,39 m: 1,78 m: 2,43 4,7 Hz 5,5 Hz 6,2 Hz H7 H8 (a,b) H9 (a,b) H10 H11 Sex 1,78 m(1,98-2,05) m(1,86-1,9) Sext(3,38) Oct(1,2-1,48) 1,8 Hz 4;7,5 Hz 3.2.2.2. Phổ C-NMR13
Phổ 13C-NMR của artemisinin [hỡnh 11, phụ lục 4] xuất hiện 15 tớn hiệu ứng với 15 nguyờn tử cacbon trong phõn tử artemisinin.
Hỡnh 10: Phổ 13C, DEF 90 và DEF 135 NMR của artemisinin
Để xem phõn tử artemisinin cú bao nhiờu nhúm –CH3, -CH2- và -CH-, chỳng tụi tiến hành đo phổ DEF 90 và DEF 135. Dựa và cỏc tớn hiệu trong phổ, sự gỏn phổ được thực hiện dễ dàng hơn. Phổ DEF 90 và DEF 135 cho thấy, phõn tử artemisinin cú 4 nhúm -CH2- và nhúm –CH= và CH3.
Kết quả gỏn phổ 13C-NMR của artemisinin được đưa ra ở bảng:
Bảng 2: Cỏc dữ liệu phổ 13C-NMR của artemisinin
Cacbon δ Cacbon δ Cacbon δ
C1 C2 C3 C4 C5 37,5 33,6 35,9 105,3 93,7 C6 C7 C8 C9 C10 79,5 44,9 24,8 23,3 32,9 C11 C12 C13 C14 C15 50,1 172,0 25,1 12,5 19,8
Như vậy, bằng phương phỏp phổ hồng ngoại, phổ NMR (1H-NMR và
13C-NMR) chỳng tụi thấy rằng cỏc tớn hiệu dường như đó trựng khớp với cấu trỳc của artemisinin như sau:
O O O O O H3C CH3 H H CH3 Cấu trúc I 3.2.2.3. Cỏc phổ 2 chiều
Để khẳng định chớnh xỏc cấu trỳc trờn, chỳng tụi sử dụng thờm phổ hai chiều. Đõy là cỏc phương phỏp phổ dựng để kiểm tra cấu trỳc giải được một cỏch nhanh nhất. Đặc biệt đối với hoỏ học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, cấu trỳc của cỏc hợp chất phõn lập được rất cồng kềnh, sự tương tỏc giữa cỏc proton với nhau rất phức tạp, cỏc phương phỏp phổ NMR một chiều đụi khi khụng phản ỏnh một cỏch chớnh xỏc cấu trỳc của hợp chất, đặc biệt là cấu trỳc lập thể. Ngày nay phương phỏp phổ 2 chiều như 1H-1H COSY, 1H-1H NOESY,
1H-13C HMQC, 1H-13C HMBC sẽ cho phộp chỳng ta xỏc định chớnh xỏc cỏc nhúm –CH=, -CH2-, -CH3 trong phõn tử. Ngoài ra, nhờ cỏc phổ này mà chỳng ta cũn biết cỏc nhúm nào gần nhau nhờ sự tương tỏc gần nhau của cỏc proton và cacbon 13 trờn phổ đồ.
Trở lại với cấu trỳc của artemisinin vừa phõn lập được, để xem xột cỏc proton và cỏc bon nào thuộc cựng một nhúm, chỳng tụi sử dụng phổ HMQC [hỡnh 12, phụ lục 5]
Hỡnh 12: Phổ HMQC của artemisinin
Phổ này thể hiện sự tương tỏc của cỏc proton gắn trực tiếp với nguyờn tử cacbon đang xột. Trờn phổ HMQC, cỏc tương tỏc (C14 – H14), (C15 – H15), (C9 – H9a,b), (C8 – H8a,b), (C13 – H13)... được thể hiện rất rừ ràng. Nhờ đú chỳng
tụi khẳng định sự gỏn phổ 1H-NMR và 13C-NMR là hoàn toàn chớnh xỏc. Phổ tương tỏc C-H qua nhiều liờn kết (HMBC [hỡnh 13, phụ lục 6]) cũng cho thấy cỏc tương tỏc hoàn toàn hợp lý của cỏc C-H qua nhiều hơn một liờn kết. Cỏc kết quả cũng khẳng định thờm những kết luận về cấu trỳc ở trờn.
Hỡnh 13: Phổ HMBC của artemisinin
Cuối cựng để xem xột tương tỏc giữa H-H cỏch nhau một liờn kết chỳng tụi sử dụng thờm phổ 1H-1H-COSY [Hỡnh 14, phụ lục 7]. Cỏc tương tỏc giữa cỏc proton gần nhau đó cho thấy cấu trỳc của artemisinin được khẳng định là cấu trỳc (I). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận: Bằng cỏc phương phỏp phổ hiện đại, chỳng tụi thấy sản phẩm phõn lập được từ cõy Artemisia annua là một sesquiterpen c15 với cấu trỳc như sau (cấu trỳc artemisinin)
O O O O O H3C CH3 H H CH3
3.3. HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RẫT CỦA ARTEMISININ
Xuất phỏt từ ứng dụng của cõy thanh hao hoa vàng chống sốt rột cũng như sàng lọc cỏc chất cú hoạt tớnh sinh học từ một số cõy thuốc Việt Nam trong dự ỏn hợp tỏc Hàn Việt, hoạt tớnh khỏng sốt rột của artemisinin được đỏnh giỏ với một số hoạt tớnh khỏng sốt rột của một số hoạt chất từ cỏc cõy khỏc.
Hoạt tớnh khỏng sốt rột của artemisinin được tiến hành theo phương phỏp đo sự đồng hoỏ đồng vị của phúng xạ của ký sinh trựng trong quỏ trỡnh xõm nhiễm và nhõn lờn khi nuụi cấy trong mụi trường cú chứa hồng cầu người theo phương phỏp của Desjardin và cỏc cộng sự [16], quy trỡnh được túm tắt như sau
Ký sinh trựng được nuụi cấy liờn tục trong mụi trường RPMI 1640 (Gibco) cú bổ sung 32 mM NaHCO3 (Gibco), 25 mM HEPES (sigma) và 10% plasma huyết thanh người tup A+ đó khử bổ thể và duy trỡ ở nhiệt độ 37°C ở độ khụng khớ 5%O2, 5%CO2 và 90%N2. 200 ml dung dịch hồng cầu 1% đó gõy nhiễm P.falciparum (0,5-1%) được bổ xung vào phiến nhựa vi lượng 96 lđó chứa sẵn 25 àl dung dịch chất cần thử với nồng độ cỏc chất cần thử được pha loóng khỏc nhau. Cỏc thuốc khỏng sốt rột như quinin, mefloquinin, chloroqin được sử dụng làm thuốc chuẩn làm chứng dương tớnh. Phiến được ủ 24 giờ trong điều kiện như trờn, sau đú 0,5m Ci của [3H (G)] hypoxanthin
được thờm bổ xung vào cỏc vi lỗ và phiến được ủ lại trong buồng ẩm ở ỏp suất và nhiệt độ trờn thờm 18 giờ. Thử nghiệm được kết thỳc bằng cỏch lọc bằng giấy lọc, sợi thuỷ tinh trờn mỏy thu giữ tế bào bỏn tự động. Hoạt tớnh phúng xạ được đo trờn mỏy đếm nhấp nhỏy lỏng Wallac Micobeta. Giỏ trị IC50 được đỏnh giỏ thụng qua nồng độ ức chế đồng hoỏ đồng vị phúng xạ tới 50% kí sinh trựng. Mẫu đối chứng khụng cú thuốc được coi là đồng hoỏ 100%. Kết quả định tớnh khả năng chống sốt rột của artemisinin cho thấy, chất này cú khả năng chống lại cỏc kí sinh trựng sốt rột dũng D6 và dũng W2. Để nghiờn cứu một cỏch định lượng, hoạt tớnh chống sốt rột được đỏnh giỏ chớnh xỏc thụng qua giỏ trị IC50. Kết quả nghiờn cứu hoạt tớnh này của một số chất được đưa ra ở bảng
Bảng 3: Giỏ trị IC50 – hoạt tớnh chống sốt rột của artemisinin
Tờn mẫu Nồng độ ban đầu
mg/ml Dũng D6 – Mẫn cảm chloroquin Dũng W2 -Khỏng chloroquin Chloroquin 250 2,9 21,8 Mefloquin 250 2,5 2,3 Quinin 250 9,8 57,8 Artemisinin 62,5 2,5 2,3
Kết quả chỉ ra rằng, hợp chất artemisinin cú hoạt tớnh chống sốt rột rất tốt, giỏ trị IC50 với dũng D6 (mẫn cảm với chloroquin) là 2,5 mg/ml và với dũng W2 (khỏng chloroquin) là 2,3 mg/ml với nồng độ ban đầu của thử nghiệm là 62,5 mg/ml. Trong cựng điều kiện nghiờn cứu, cỏc hợp chất chloroquin, mefloquin, quinin đều được thử nghiệm với nồng độ ban đầu là 250 mg/ml nhưng kết quả thử nghiệm lại cho thấy artemisinin lại cú khả năng chống sốt rột cao nhất.
Kết luận
1. Đó thu hỏi và xử lý mẫu cõy Artemisia annua.
2. Đó phõn lập được hoạt chất artemisinin từ cõy Artemisia annua bằng cỏc phương phỏp sắc kớ khỏc nhau.
3. Đó kiểm tra độ sạch, cỏc thụng số vật lý như điểm chảy, sắc kớ bản mỏng... Đó xỏc định được cấu trỳc của artemisinin bằng cỏc phương phỏp vật lớ hiện đại nhất hiện nay như phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEF 90, DEF 135, COSY.
4. Hợp chất này đó được thử nghiệm hoạt tớnh sốt rột qua Viện Hoỏ học cỏc hợp chất thiờn nhiờn tại Viện Nghiờn cứu Sinh học và Cụng nghệ Sinh học Hàn Quốc. Kết quả cho thấy artemisinin là một trong những hoạt chất cú khả năng khỏng sốt rột trờn người tốt nhất hiện nay.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. K.Paech and M.V.Tracey (1955). Modern methods of plant analysis SPRIGER – VERLAC – BERLIN – HEIDELBERG p. 254 2. J.H.Harborn (1984) Phytochemical methods second edition.
LONDON – NEWYORK pp. 102 – 141
3. Raphael Ikan (1991). Natural products a laboratory guide second edition. LONDON – SEDNEY – TORONTO pp. 168 - 225
4. T.W Graham Solomons (1997). Fundementals of organic chemistry. John Wiley & sons. In pp. 979 – 992
5. Richard J.P Cannell (1998). Natural products isolation human press. TOTOWA, NEW JESEY (USA)
6. Russell J.Molyneux; Steven M.Colegate (1993). Bioactive Natural Products. CRC Press. LONDON – TOKYO pp. 319 – 346
7. Trager, W. and Jensen, J.B (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science 193, pp. 673 – 675
8. Chen, M . , Theander, TG, Christensen, S.B. , Hviild, L. , Zhai, L . and Kharazmi, A (1994). Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits
in vitro growth of the human malaria parasite Plasmodium falciparum
and protects mice from P. yoclii infection. Antimicrod. Agents
chemother, 38 . 1470 – 1475
9. Angerhofer, C . K . , Konig, G .M . , Wright, A.D. ,Sticher, O. ; Milhous, W.K . , Cordell, G.A. , Farnsworth, N.R and Pezzuto, J . M . (1992). Selective screeming of natural products. A resource for the discovery of novel antimalarial compounds.
In: ATTA-UR-RAHMAN (ed). Avandces in natural products chemistry. Chur, Harwood Academic Publisher pp. 311 – 329 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10.Peter, W (1980) In: Malaria vol.1 , KREIER, J.P. (ed). New York,
11.Corrado Tringali (2001), Bioactive compounds from natural sources. LONDON and NEW YORK
12.Vừ Văn Chi (1999). Từ điển cõy thuốc Việt Nam, nhà xuất bản y học Tr. 818
13.Tạp chớ cõy thuốc quớ, số 16 (5/2004) Tr. 12
14.Yeung – Jin Chang, Seung – Hwan Song; Si – Hyung Park and Soo – Un Kim (2000). Amorpha - 4, 11-diene synthase of Artemisia annua : cDNA isolation and bacterial expression of terpene synthase involved in artemisinin biosynthesis. Archives of Biochemistry.
15.T.Eelco Wallaart, Harro J. Bouwmeester, Jacques Hille, Lucas Poppinga, Niels C.A. Maijers (2001). Amorpha - 4,11 - diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin . Planta 212 pp. 460 – 465
16.Desjadin R.E. , Canfiel C.J. , etal (1979), “Quanlitative assessment of antimalarial activity in vitro by semiautomatic microdilution technique”
Antimicrob Agents Chemother, 16, p 710
17.T.Eelco Wallaart, Niesko Pras, Aaron C. Beekman, and Wim . Quax (2000). Seasonal variation of artemisinin and its biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua of different geographical origin: proof for the existence of chemotypes. Planta Medica 66 pp. 57 – 62.
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU...1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...2
1.1. Giới thiệu về Terpen...2
1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phõn bố trong tự nhiờn...2
1.1.2. Cấu trỳc của terpen...3
1.2. Hoạt tớnh chống sốt rột của cỏc hợp chất thiờn nhiờn...9
1.3. Giới thiệu về cõy ARTEMISIA ANNUA...14
1.3.1. Atemisimin và hoạt tớnh khỏng sốt rột...15
1.3.2. Cơ chế tỏc dụng của artemisinin...15
1.3.3. Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua...17
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU...21
Hoỏ chất dụng cụ...21
Cỏc phương phỏp nghiờn cứu...22
2.1. Thu hỏi mẫu...22
2.2. Phương phỏp chiết hồi lưu núng...22
2.3. Phương phỏp chạy sắc kớ lỏng chõn khụng...23
2.3.1. Chuẩn bị cột...23
2.3.2. Tiến hành chạy sắc kớ lỏng chõn khụng...24
2.4. Phương phỏp chạy sắc kớ cột...25
2.5. Phương phỏp đo điểm chảy...27 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.6. Cỏc phương phỏp phổ xỏc định cấu trỳc...27
2.7. Phương phỏp thử hoạt tớnh chống sốt rột của artemisinin...27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...28
3.1. Thu hỏi và hàm lượng Artemisia annua ở Việt Nam...28
3.2. Xỏc định cấu trỳc của artemisinin...30
3.2.1. Phổ hồng ngoại...31
3.2.2. Kết quả xỏc định artemisinin bằng phổ NMR...33
3.3. Hoạt tớnh chống sốt rột của artemisinin...38
KẾT LUẬN...40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...41 PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 PHỤ LỤC 6 PHỤ LỤC 7 PHỤ LỤC 8 PHỤ LỤC 9