3. ENZYME CỐ ĐỊNH
3.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định
Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hòa tan).
CÔNG NGHỆ ENZYME
Enzyme có thể thay đổi về pH, nhiệt độ hoạt động, cũng như các giá trị của hằng số Michaelis – menten và tính chất đặc hiệu, tuy nhiên những thay đổi này còn phụ thuộc nhiều vào bản chất hóa học của chất mang. Nói chung enzyme cố định thường bền với các tác nhân biến tính hơn, nhưng hoạt độ riêng thường thấp hơn enzyme hòa tan.
Một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt tính của enzyme cố định là tương tác protein – protein giữa các phân tử enzyme đã được liên kết. Trong mọi trường hợp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lượng enzyme được kết hợp vào trên một đơn vị trọng lượng của chất mang.
Nhìn chung, các enzyme cố định vẫn giữ được tính đặc hiệu của mình. Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có độ bền vững lớn đối với tác động khác nhau.
a) Hoạt tính của enzyme không tan phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của chất mang
Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền vững cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hóa học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.
Dẫn xuất enzyme không tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kị nước.
Khi enzyme được giới hạn trong phạm vi môi trường xác định, sẽ xảy ra nhiều kiểu tương tác khác nhau của chất mang polymer lên môi trường vi mô bao xung quanh phân tử enzyme cố định.
Thứ nhất: polymer nhờ vào những tính chất lý hóa học đặc trưng sẽ kéo tới bề mặt của enzyme (hoặc đẩy khỏi enzyme) cơ chất, sản phẩm của phản ứng và các phân tử khác, điều này làm tăng (hay giảm) nồng độ của những chất này trong môi trường vi mô ở sát enzyme.
Thứ hai: bản thân chất mang polymer ngăn cản sự khuếch tán tự do của các phân tử theo hướng tới enzyme cũng như đi khỏi enzyme, từ đó ảnh hưởng đến hiệu quả xúc tác của enzyme.
b) Hoạt tính của enzyme không tan phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác
Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố: Kích thước lỗ gel của chất mang polymer
Trọng lượng phân tử của cơ chất
Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do
Những hạn chế về mặt khuếch tán cũng có ý nghĩa đáng kể trong quá trình sử dụng hệ thống enzyme cố định. Đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò hàng đầu. Song những hạn chế khuếch tán không chỉ đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường xung quanh enzyme và dung dịch tự do. Hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn tới sự thay đổi nồng độ của cơ chất và sản phẩm phản ứng ở vùng môi trường vi mô xung enzyme. Điều này làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzyme cố định. Sự xuất hiện của gradient nồng độ nói trên được giải thích bởi tốc độ khuếch tán thấp các phân tử trong gel và hoạt tính xúc tác cao của enzyme
Những giới hạn khuếch tán có thể được thể hiện ở hai dạng: hàng rào khuếch tán bên ngoài và bên trong. Rào khuếch tán bên ngoài xuất hiện là do có sự tồn tại của lớp mỏng dung môi không pha trộn bao xung quanh hạt polymer. Các chất khuếch tán vào lớp này nhờ có sự kết hợp của khuếch tán phân tử thụ động và sự đối lưu. Độ dày của lớp này phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn của dung môi xung quanh các hạt chứa enzyme cố định. Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch tán bên ngoài, vì vậy trong bất kì quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò hết sức quan trọng.
Rào khuếch tán bên trong là sự giới hạn khuếch tán tự do ở bên trong chất mang polymer do chính chất mang gây ra. Trong giới hạn của hạt polymer chỉ có sự khuếch tán phân tử thụ động không bị ảnh hưởng bởi tốc độ pha trộn. Rào khuếch tán bên trong sẽ biểu hiện rõ ràng hơn nếu như enzyme được cố định bằng cách đưa nó vào trong chất mang polymer chứ không phải gắn nó vào bề mặt của chất mang.
CÔNG NGHỆ ENZYME
c) Ảnh hưởng của pH lên enzyme không hòa tan
Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể lên pH tối ưu của enzyme cố định. pH tối ưu của enzyme cố định có thể dịch chuyển về phía pH kiềm hay pH acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan. Sự dịch chuyển pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên. Sự có mặt của trường tĩnh điện mạnh dẫn tới nồng độ H+ gần chất mang và trong dung dịch khác nhau. Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, còn gần chất mang điện tích dương thấp hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dịch sang phía pH kiềm so với enzyme hòa tan, ngược lại nếu enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang mang điện tích dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. Còn khi lực ion lớn điện tích của chất mang được làm trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzyme cố định gần giống như của enzyme hòa tan.