2.3.1. Xử lý mẫu
Vỏ quả Măng cụt tươi ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 4 tuần. Sau đó, thu dịch chiết lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao ethanol. Cao ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi điclometan, n-hexan và etylacetat thu được các dịch chiết, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao chiết tương ứng.
2.3.2.1. Định tính flavonoids [16, 24]
Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc.
- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính .
2.3.2.2. Định tính tannins
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
2.3.2.3. Định tính các polyphenols khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.3.2.4. Định tính glycoside
Phản ứng Keller-Killian:
Thuốc thử Keller-Killian:
Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10%.
Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc.
Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.3.2.5. Định tính alkaloids
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.3.3. Định lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết vỏ Măng cụt [40]
* Phương pháp: Định lượng hợp chất phenolics tổng số của dịch chiết ban đầu theo phương pháp Folin-Ciocalteau.
* Nguyên tắc: Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất phenolics trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn.
- Cân 10mg mỗi loại cao và hòa loãng trong 1ml ethanol 90%
- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
- Dung dịch axit gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh
- Chuẩn bị 6 bình định mức 100 ml, sau đó cho vào mỗi bình 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml acid gallic chuẩn, sau đó dẫn nước cất tới 100 ml sẽ thu được dung dịch acid gallic các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l. Dựng đường chuẩn axit gallic.
* Tiến hành:
- Cho vào mỗi cuvet định lượng 20l mẫu thử + 1,58ml H2O + 100l thuốc thử Folin – Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300l Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch trong 2h ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Bảng 1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic:
STT Gallic acid (mg/l) OD765n m 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg/l axit gallic O D 7 6 5 n m OD 765nm
2.3.4. Phƣơng pháp tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đƣờng [19,31,41,43] 2.3.4.1. Phân nhóm động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dùng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh được cân từng con, đánh dấu, phân lô ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm. Chuột được chia làm 11 lô, mỗi lô gồm 6 con.
a)Tạo mô hình chuột béo phì
Lô nuôi thường (lô 1): Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).
Các lô còn lại (lô 2 đến lô 11): Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, đậu tương, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước…
Thời gian nuôi chuột theo 2 chế độ ăn là 4 tuần.
Bảng 2. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 40 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 2 Chất khoáng 4
Vitamin & axit amin 2
Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt nam và theo các tài liệu tham khảo [19, 41, 43]
Sau 4 tuần nuôi, tiến hành cân trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh như: glucose máu, lipid máu gồm Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn.
b) Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng streptozotocin (STZ) liều thấp.
Sau khi chuột được nuôi béo phì thực nghiệm thành công chúng tôi tiếp tục tiến hành gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ liều thấp. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn
đói 16h, tiêm màng bụng STZ gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình ĐTĐ typ 2 phát triển từ béo phì. Sau đó chuột được tiếp nhận thức ăn bình thường. Sau 2 – 3 ngày chúng tôi tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt.
c) Phân lô chuột thí nghiệm
Sau khi đã tạo được chuột béo phì và chuột ĐTĐ typ 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệm như sau :
Lô 1: Chuột bình thường, uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% (lô đối chứng âm) Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị (lô đối chứng dương)
Lô 3: Chuột béo phì điều trị bằng thuốc Metformin Lô 4: Chuột béo phì, điều trị bằng cao ethanol Lô 5: Chuột béo phì, điều trị bằng cao etylacetat
Lô 6: Chuột béo phì, điều trị bằng cao n-hexan
Lô 7: Chuột ĐTĐ typ 2, không điều trị
Lô 8: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng thuốc Metformin
Lô 9: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao ethanol
Lô 10: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao etylacetat Lô 11: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao n-hexan
Thời gian điều trị bằng các cao phân đoạn dịch chiết ethanol, etylacetat, n- hexan và metformin là 21 ngày.
2.3.4.2. Thử độc tính cấp xác định LD50 bằng đƣờng uống [32]
Xác định LD50 của dịch chiết vỏ quả măng cụt theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm. Chuột bình thường được nhịn đói trước 16h thí nghiệm (phân lô ngẫu nhiên N = 10) và được cho uống theo liều tăng dần từ
5000 đến 8000 mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết vỏ quả măng cụt.
2.3.4.3. Pha thuốc và hóa chất thí nghiệm
1. Dung dịch NaCl 0,9% 2. Metformin (500mg/kg)
3. Cao dịch chiết phân đoạn (2000mg/kg) 4. Streptozotocin (STZ) (110 mg/kg) 5. Thức ăn có hàm lượng béo cao
2.3.4.4. Tiến hành thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm Kiểm nghiệm Bắc Giang. Chuột được cho ăn thức ăn tổng hợp, thức ăn có hàm lượng béo cao và uống nước đun sôi để nguội. Các lô chuột được nuôi trong các lồng riêng biệt để tránh lây chéo có thể xảy ra qua đường hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm. Chuột được cho uống vào các buổi sáng vào giờ nhất định. Thời gian nuôi béo trong 28 ngày và thời gian điều trị trong 21 ngày.
2.3.4.5. Theo dõi thí nghiệm
Để thí tiến hành thí nghiệm đạt kết quả như mục tiêu đề ra, chúng tôi theo dõi chặt chẽ các bước thí nghiệm, cụ thể như: Quan sát tình trạng ăn uống, bài tiết, vận động,... Sau 3 ngày cân lại một lần.
2.3.4.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm
Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh để thu máu. Máu được xác định các chỉ số: Glucose Cholesterol, Triglycerid, HDLC, LDLC, GOT và GPT. Đây là những chỉ số đáng tin cậy để đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn vỏ quả măng cụt.
2.3.5. Phƣơng pháp xác định một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột trƣớc và sau khi điều trị bằng bằng dịch chiết trên máy phân tích tự động OLYMPUS AU 640
2.3.5.1. Định lƣợng glucose huyết theo giai đoạn thực nghiệm
* Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O-Dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2).
Glucose + O2 glucose oxidase axit gluconic + H2O2 (1) O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O (2)
Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang ( = 500nm) tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng.
* Mẫu máu: Máu toàn phần lấy một giọt từ đuôi chuột. Định lượng glucose máu bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA).
2.3.5.2. Định lƣợng Triglycerid huyết thanh
* Nguyên lý: Thuỷ phân Triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4- aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Triglycerid lipoproteinlipase
Glycerol + acid béo
Glycerol + ATP glycerolkinase
Glycerol–3–phosphate + ADP
Glycerol–3–phosphate +O2 g l y c e r o l3p h o s p h a t eo x i d a s e
Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4-chlorophenol peroxidase
Quinonimin + 4HCl + 4H2O
* Tính kết quả: Đo mật độ quang học Quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại.
2.3.5.3. Định lƣợng cholesterol toàn phần trong huyết thanh
* Nguyên lý: Thuỷ phân Cholesterol este bằng enzyme Cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng Cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:
Cholesterol este + H2O CHE
Cholesterol + acid béo
Cholesterol + O2 CHO
Cholesterol–3– one + H2O2
2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Peroxidase
Quinonimin + H2O
* Tính kết quả : So mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn
2.3.5.4. Kết quả thử hoạt tính α-glucosidase in vitro
* Nguyên tắc:
Chúng ta biết rằng, α-glucosidase được tiết ra từ ruột non giúp chuyển hóa các phân tử đường oligosacaride thành những phân tử glucose. Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase bằng cách sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) như là cơ chất ban đầu và bị α-glucosidase thủy phân sinh ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Dựa vào lượng p-nitrophenol sinh ra, tiến hành đo quang tại bước sóng 400nm.
1 unit (hay 1 U) của enzym α-glucosidase được định nghĩa như là lượng enzym giải phóng 1.0 μmol của PNP-G tại điều kiện phân tích xác định.
HO HO O OH OH OH OH NO2 HO HO O OH OH O O2N α-glucosidase p-nitrophenol α-D-glucose
Khi mẫu có chất hoạt tính ức chế α-glucosidase (chẳng hạn dịch chiết thực vật) thì hàm lượng của p-nitrophenol tạo thành sẽ giảm. Hàm lượng p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quang hấp thu tại bước sóng là 400nm.
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 (là nồng độ ức chế 50%).
Cách tính IC50
Khả năng ức chế α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I %). Phần trăm ức chế (I %) được xác định theo công thức:
Với:
Ao: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất ức chế. As: Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu có hoạt chất ức chế.
IC50 được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Từ giá trị I%, ta tính được giá trị IC50
Phương pháp tiến hành
Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH = 6.8, enzym α-glucosidase, chất ức chế với thể tích đã định trước. Tiến hành ống nghiệm đối chứng: đệm pH = 6.8, enzym và dung dịch mẫu trắng cùng thể tích, không chứa chất ức chế.
Hoạt hóa hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút.
Thêm cơ chất PNP-G, duy trì phản ứng ở 370C, lắc đều, trong thời gian 20 phút.
Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9.6
I (%) =
Ao *100%
Đo độ hấp thu A ở λ = 400nm, từ đó xác định % ức chế (%I) và suy ra chỉ số IC50
Chuẩn bị mẫu thử:
- Điều kiện phản ứng: T = 370C, pH = 6.8, nồng độ enzym 0.031U/ml, nồng độ cơ chất PNP-G 0.085mM.
- Chuẩn bị các mẫu ức chế có nồng độ 2.95mg/ml tương ứng với nồng độ 100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Pha loãng để có các nồng độ 75, 50, 25, 5 μg/ml. Thực hiện đối với mỗi nồng độ (Ci) của từng mẫu thử theo bảng sau:
Bảng 3 : Quy trình của một mẫu thử hoạt tính
CÁC CHẤT
THỂ TÍCH (ml)
Mẫu trắng Mẫu ức chế Mẫu không ức chế
Nước khử ion 0.2 0 0.2 Đệm phosphate pH=6.82 5.0 5.0 5.0 Enzym 0 0.2 0.2 Chất ức chế có nồng độ Ci (dịch chiết thực vật) 0.2 0.2 0 Ủ ở 370C trong 30 phút PNP-G 0.5 0.5 0.5 Lắc đều, ủ ở 370C trong 20 phút
Lấy 2ml mỗi hỗn hợp cho vào ống nghiệm có sẵn 8ml đệm pH = 9.62, lắc đều Đo độ hấp thu ở 400nm trên máy quang phổ UV-Vis và tính theo công thức I (%)
2.3.6. Xác suất thống kê toán học xử lí số liệu:
Sử dụng chương trình Microsoft Office – Excell: Nạp các số liệu, dùng hàm AVERAGE để tính giá trị trung bình và hàm VAR để tính sai số, vẽ biểu đồ, lập các bảng biểu .
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN