2 0.65 270 14 30 3.3 0.16 0.07 8 0.25 0.29 1.8 0.34 2.2 0.7 3 2.1 180 16 17 1.0 0.23 0.24 0.44 0.7 1 1.7 0.13 3.3 0.5 6 0.92 Mỡ lợn 230 15 66 1.5 0.25 0.43 0.63 0.6 7 1.7 0.16 3.1 0.7 8 1.2 270 16 81 1.6 0.26 0.44 0.7 0.65 2.8 0.12 3.3 1.1 1.1
Từ bảng trên ta thấy rằng lượng PAHs ở sản phẩm chiên bằng mỡ thì nhiều hơn so với chiên bằng dầu cải dầu và nhỏ nhất là chiên bằng dầu nành.
4.6. Phương pháp kiểm tra, phân tích:
Quá trình phân tích PAHs gồm các bước sau: quá trình xà phòng hóa, có thể kết hợp hoặc thay thế bằng quá trình trích ly bằng dung môi hòa tan, sau đó là quá trình tinh sạch bằng cột với chất mang rắn SPE hoặc cột sắc ký áp suất thấp (chất nhồi cột là alumina, silicagel, Sephadex LH – 20) hoặc quá trình phân lớp lỏng - lỏng, cuối cùng là phương pháp phân tách và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hoặc sắc ký khí.
Quá trình phân tích PAHs gặp những khó khăn chủ yếu sau: khó khăn trong quá trình tách PAHs vì PAHs tồn tại lượng rất nhỏ trong thực phẩm và kết quả thường bị nhiễu do lipid và các tạp chất cũng hòa tan trong các dung môi dùng trích ly PAHs, khó khăn trong quá trifnh định lượng vì PAHs không tồn tại dạng đơn chất mà là một hỗn hợp nhiều chất phức tạp có cấu tạo tương tự nhau phụ thuộc vào từng loại thực phẩm. Do đó quá trình phân tích PAHs đòi hỏi thiết bị có độ nhạy và độ chọn lọc cao [19].
Để kiểm soát hiệu suất thu hồi mẫu và lượng mẫu thất thoát trong suốt quá trình xử lý mẫu người ta bổ sung chất nội chuẩn sau quá trình đồng hóa mẫu. Một số chất nội chuẩn thường được sử dụng như: [13C3-pyrene (m/z 205), 13C6-fluoranthene (m/z 208), fluoranthene and pyrene (m/z 202, 101). Yêu cầu đối với chất nội chuẩn là có tính chất hóa, lý học giống như của hợp chất PAHs chuẩn [10].
4.6.1.Quá trình trích ly – tinh sạch:
Có nhiều phương pháp để trích ly và tinh sạch PAHs khỏi mẫu như:
Phương pháp Soxhlet gồm những bước như: trích ly PAHs và xà phòng hóa chất béo bằng dung dịch methanol trong dung môi là potassium hydroxide (KOH), cuối cùng tinh sạch bằng cột với chất mang rắn Sep – Pak Florisil. Mẫu sau khi tinh sạch được dùng để chạy sắc ký khí (GC) hoặc sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [19].
Hoặc ta cũng có thể trích ly PAHs bằng phương pháp trích ly lỏng cao áp với thiết bị trích ly gia tốc ASE 300 (Accelerated Solvent Extractor), (Dionex Corp) có cấu tạo gồm một lớp lọc bằng cellulose dày 60 ml ở dưới đáy của dụng cụ ASE, tiếp theo đến lớp celite dày 1.0 g và cuối cùng là lớp florisil dày 15.0 g (đóng vai trò là pha tĩnh của quá trình trích ly).
Mẫu Lọc Pin
Hình 4.11: Cấu tạo của thiết bị trích ly gia tốc ASE 300
Quá trình trích ly như sau: Nghiền mịn và sấy khô mẫu rồi pha loãng với chất nội chuẩn. Mẫu (1.0g) đã sấy khô được đặt vào trên đỉnh của dụng cụ ASE (như hình vẽ). Quá trình trích ly được thực hiện với pha động là hỗn hợp dung dịch hexane/acetone (50/50, v/v). Sự kết hợp pha tĩnh (celite/florisil) được lắp trên cột và pha động hexane/acetone làm tăng hiệu quả trích ly, tuy nhiên florisil có thể hấp phụ một lượng nhỏ PAHs nên trước khi sử dụng cần có quá trình giải hấp phụ bằng dichloromethane [10].
Sau quá trình trích ly mẫu được tinh sạch bằng cột với chất mang rắn SPE (Envi Chrom- P). Ban đầu mẫu được rửa với hỗn hợp cyclohexane/ethanol (70/30, v/v), sau đó mẫu được phân tách bằng pha động là cyclohexane/ethyl acetate (40/60, v/v). Dịch trích ly sau quá trình tinh sạch được cho vào dung môi toluene và đem phân tích bằng phương pháp GC/MS/MS.
Trong số các phương pháp tinh sạch như sắc ký gel thẩm thấm, dùng silica gel ...thì phương pháp tinh sạch sử dụng florisil là phổ biến nhất. Ngoài ra người ta còn sử dụng cột SPE với chất nhồi là polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) để tinh sạch PAHs. Quá trình vận hành tối ưu cho cột này là rửa cột với ethyl acetate để loại hết PAHs còn sót trong cột (thường chứa khoảng 1ng các chất như pyrene, fluoranthene và benzo [g,h,i]perylene), rồi mới tiến hành tinh sạch. Và để tăng thêm hiệu quả của quá trình tinh sạch ta tiến hành bốc hơi mẫu sau khi kết thúc tinh sạch, tuy nhiên quá trình bốc hơi này lại làm tổn thất khoảng 20 – 70% các hợp chất PAHs có 3 vòng. Để giảm tổn thất này cần thực hiện quá trình bốc hơi dưới điều kiện khí trơ (nitơ) ở nhiệt độ khoảng 400C và ngừng cấp khí nitơ ngay khi mẫu được cô cạn [10].
4.6.2.Phương pháp phân tích định tính và định lượng:
Cho đến nay hai phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong phân tích định tính và định lượng PAHs trong thực phẩm là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khí (GC).
Đối với hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) loại đầu dò thường được dùng nhiều nhất là đầu dò fluorescence và đầu dò UV. Với đầu dò UV ở bước sóng 254 nm có thể phân tích được cả 16 loại PAHs trong khi đó thì đầu dò fluorescence phải tiến hành phân tích ở 7 bước sóng khác nhau mới phân tích được 16 loại PAHs, tuy nhiên so với đầu dò UV thì đầu dò fluorescence có khả năng phân tích PAHs ở nồng độ thấp hơn nên nó vẫn được sử dụng rộng rãi hơn.
Ở hệ thống sắc ký khí (GC) để đạt hiệu suất phân tích cao thường sử dụng các cột mao dẫn và các loại đầu dò thường được dùng nhiều nhất là đầu dò ion hóa bằng ngọn lửa (FID), đầu dò ion hóa bằng ánh sáng (PID), đầu dò ITD (ion – trap mass detector) hoặc kết hợp sắc ký khí với khối phổ (GC – MS). Trong đó phương pháp GC – MS được sử dụng nhiều nhất vì khả năng phân tích và độ nhạy cao, và có thể thêm phần định danh các PAHs ở trong mẫu [56].
4.6.3.Cách tính kết quả:
Đối với hệ thống sắc ký lỏng cao áp: PAHs trong mẫu được định tính bằng cách so sánh thời gian lưu trong cột và phổ hấp thu của hợp chất chưa biết với thời gian lưu trong cột và phổ hấp thu của hợp chất PAHs tiêu chuẩn, và bằng phương pháp thêm mẫu đối chứng (hợp chất PAHs tiêu chuẩn). Việc định lượng PAHs được thực hiện bằng phương pháp nội chuẩn (hoặc ngoại chuẩn).
Đối với hệ thống sắc ký khí: PAHs trong mẫu được định tính bằng cách so sánh thời gian lưu trong cột của hợp chất chưa biết với thời gian lưu trong cột của hợp chất PAHs tiêu chuẩn trên sắc phổ ion ghi được, và bằng cách so sánh khối phổ của hợp chất chưa biết với hợp chất PAHs tiêu chuẩn. Việc định lượng PAHs được thực hiện bằng phương pháp định lượng tương đối. 4 nồng độ của 16 hợp chất PAHs tiêu chuẩn từ 0.5 ppb đến 20 ppm được trích vào hệ thống GC. Mỗi điểm cong trên đồ thị của từng hợp chất PAHs tiêu chuẩn thu được bằng phương pháp đánh dấu nồng độ tương ứng với diện tích của từng ion base, từ đó tính ra phương trình hồi quy và hệ số tương quan (r2) của phương trình. Đối với phương pháp sắc ký khí nồng độ mỗi chất PAHs trong mẫu được xác định dựa vào công thức sau:
Với:
Ws: là nồng độ của PAHs trong mẫu
As: nồng độ của PAHs tiêu chuẩn có liên quan đến diện tích peak khi bơm thể tích mẫu.
a: độ dốc của đường hồi quy.
R: hiệu suất thu hồi mẫu của quá trình xử lý mẫu
Xác định hiệu suất thu hồi mẫu R: Các hiệu suất thu hồi ở các mẫu khác nhau thì khác nhau do đó cần làm thí nghiệm đối với mỗi lần phân tích. Nguyên tắc là hiệu suất thu hồi được tính bằng tỉ lệ giữa nồng độ chất nội chuẩn thu được sau quá trình phân tích với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu trước quá trình xử lý.
Thời gian phân tích bằng phương pháp GC – MS thì dài hơn so với phương pháp HPLC. Từ sắc ký đồ ta thấy rằng phương pháp HPLC có kết quả phân tách rõ ràng hơn, trong khi một số peak của phương pháp GC bị chồng lên nhau, tuy nhiên khi phân tử PAHs có khối lượng phân tủ nhỏ thì các peak tách nhau rõ ràng. Ngoài ra phương pháp HPLC còn có độ nhạy cao hơn và giới hạn phân tích thấp hơn (ngoại trừ khi dùng đầu dò fluorescence để phân tích acenaphthylene). Giới hạn phân tích của mỗi phương pháp được cho ở bảng sau:
Bảng 4.15: Tóm tắt một số phương pháp phân tích PAHs trong thực phẩm Tên thực
phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp trích ly – tinh sạch
Phương pháp sắc ký và thông số kỹ thuật Kết quả phân tích Thịt xông khói, thịt nướng (đùi gà xông khói) Phương pháp trích ly Soxhlet: xà phòng hóa chất béo bằng dung dịch methanol trong dung môi là potassium hydroxide (KOH).
Tinh sạch bằng cột
GC – MS sử dụng đầu dò ITD
Hệ thống GC Varian Model 3400 với cột mao dẫn DB – 5 (30m x 0.32 mm) với độ dày tấm phim là 0.25 µm và máy khối phổ bắt ion Saturn III (Palo Alto, CA, USA). Khí mang: He với tốc độ khí 1ml/phút. Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ dụng cụ
Phát hiện 16 PAHs. LOD: 5 – 50 pg. Hiệu suất thu hồi: 72.6% (Indeno [1,2,3-
với chất mang rắn Sep – Pak Florisil.
trích mẫu: 2800C, cột sắc ký: 700C trong 1 phút, nâng lên 1500C tốc độ 10 0C/phút và 2800C tốc độ 40C/phút, giữ 14 phút.
MS: chế độ bắt ion, khoảng scan 50-350 amu, 1 s/scan, hiệu điện thế xoay chiều là 1350V, hiệu điện thế mục tiêu là 2000V, Perfluorotributylamine được dùng làm mẫu xác định khối lượng ở các giá trị m/z 69, 131, 264, 414, 502 và 614.
96.8% (Chrysene), thời gian lưu của peak: 7.1 - 48.1 phút. [19]
HPLC: đầu dò Jasco UV – VIS 970/975, đầu dò fluorescence Jasco 821 – FP (Tokyo, Japan), cột sắc ký ODE-3029-ED, 125 x 4.6 mm, 5µm (Bedford,MA, USA).
Pha động acetonitrile:nước (55/45, v/v) chạy qua cột trong 2 phút, sau đó đặt chương trình tăng tuyến tính nồng độ acetonitrile đến khi đạt 100% trong 23 phút, giữ 15 phút, lưu lượng 1.2 ml/phút.
Bước sóng đầu dò UV: 254 nm.
Chương trình bước sóng cho đầu dò fluorescence: = 270/340 nm (naphthalene, acenaphthene, fluorene), 320/533 nm (acenaphthylene), 254/375 nm (phenanthene), 260/420 nm (anthacene, fluoranthene), 254/390 nm (pyrene, benzo(a) anthracene, chrysene), 260/420 nm (benzo(a)pyrene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, dibenzo [a,h] anthracene, benzo(ghi)perylene) và 293/498 nm (indenol [123 – cd]pyrene).
Phát hiện 16 PAHs, hiệu suất thu hồi: 72.8% (Naphthalene, đến 98.5% (Chrysene). Đầu dò UV: LOD: 0.03 – 1.54 ng, thời gian lưu của peak: 6.9 – 33.3 phút. Đầu dò fluorescence: LOD (trừ acenaphthylen e là 20 µg): 0.5 – 6 pg, thời gian lưu của peak: 7- 34 phút. [19] Thực phẩm chế biến dạng rắn Trích ly: xà phòng hóa bằng methanol 10M/potassium hydroxide (9:1, v/v), ly tâm ở 3500 rpm trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Pha nhẹ bên trên được rửa bằng n – hexane 3 lần (lắc 30 phút, ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút), bốc hơi còn 5 ml. Tiếp tục ly tâm và
HPLC: đầu dò fluorescence LS-40 fluoro- meter (Perkin-Elmer, Buckingham, UK), cột Supelcosil LC-PAH, 4.5x25 cm (Supelco, Oakville, On- Canada).
Pha động acetonitrile–water (90:10, v/v) trong 6 phút, sau đó tăng đến tỉ lệ (96:4, v/v) giữ trong 12.5 phút, rồi quay lại như ban đầu. Lưu lượng pha động 1.6 ml/phút. Bước sóng đầu dò: 333/390 và 296/405 nm dùng để phân tích pyrene và BaP.
Thời gian lưu của pyrene và BaP là 4.2 và 9.7 phút. LOD: 1 – 14nmol/l (pyrene) và 4 – 14 nmol/l (BaP).
Hiệu suất thu hồi: 83±20%
thu lấy phần nổi trên bề mặt đem cô cạn dưới điều kiện khí trơ, tái hòa tan cặn vào acetonitrile đem đi phân tích. (pyrene) và 75±13% (BaP). [14] Thực phẩm dạng lỏng như dầu, mỡ ... Trích ly: xà phòng hóa bằng methanol 10M/potassium hydroxide (9:1, v/v), ly tâm ở 3500 rpm trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Pha nhẹ bên trên được rửa bằng n – hexane 3 lần (lắc 30 phút, ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút), bốc hơi còn 5 ml. Tiếp tục ly tâm và thu lấy phần nổi trên bề mặt đem cô cạn dưới điều kiện khí trơ, tái hòa tan cặn vào acetonitrile đem đi phân tích.
Hệ thống sắc ký cho – nhận điện tử phức tạp (DACC: donor – acceptor complex chromatography).
HPLC: đầu dò fluorescence LS-40 fluoro- meter (Perkin-Elmer, Buckingham, UK), cột Supelcosil LC-PAH, 4.5x25 cm (Supelco, Oakville, On- Canada).
Pha động acetonitrile–water (90:10, v/v) giữ trong 6 phút, sau đó tăng đến tỉ lệ (96:4, v/v) giữ trong 12.5 phút, rồi quay lại như ban đầu. Lưu lượng pha động 1.6 ml/phút. Bước sóng đầu dò: 333/390 và 296/405 nm dùng để phân tích pyrene và BaP.
Thời gian lưu của pyrene và BaP là 4.2 và 9.7 phút. LOD: 1 – 14nmol/l (pyrene) và 4 – 14 nmol/l (BaP).
Hiệu suất thu hồi: 83±20% (pyrene) và 75±13% (BaP). [14]
Tóm lại thì thời gian phân tích bằng phương pháp GC – MS thì dài hơn so với phương pháp HPLC nhưng sắc ký đồ có kết quả phân tách không cao vì một số peak của phương pháp GC bị chồng lên nhau, tuy nhiên khi phân tử PAHs có khối lượng phân tủ nhỏ thì các peak tách nhau rõ ràng. Ngoài ra phương pháp HPLC còn có độ nhạy cao hơn vì nó có giới hạn phân tích thấp hơn (ngoại trừ khi dùng đầu dò fluorescence để phân tích acenaphthylene) cụ thể là giới hạn phát hiện (LOD) của 16 hợp chất PAHs đối với phương pháp HPLC khi sử dụng đầu dò UV là 0.03 – 1.54 ng, khi sử dụng đầu dò fluorescence (ngoại trừ acenaphthylene là 20µg) là 0.5 – 6 pg. Đối với phương pháp GC khi sử dụng các loại đầu dò khác nhau LOD là 5 – 50 ppb.
Như vậy thì ngoại trừ acenaphthylene thì giới hạn phát hiện (LOD) khi sử dụng đầu dò fluorescence nhỏ hơn từ 20 – 320 lần so với khi sử dụng đầu dò UV, và nhỏ hơn gần 10 lần so với phương pháp GC với các loại đầu dò ITD. Do vậy cho đến nay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với đầu dò fluorescence vẫn là phương pháp phân tích được sử dụng nhiều nhất để phân tích hàm lượng PAHs trong các loại thực phẩm khác nhau [19].
Tuy nhiên cho đến nay các phương pháp phân tích trên chỉ phân tích được 16 chất trong nhóm PAHs và chưa thể phân tích được nhóm các dibenzopyrenes và 5 – methylchrysene [83].
Hiện nay ngoài những phương pháp phân tích nêu trên người ta đã nghiên cứu nhiều phương pháp khác để rút ngắn thời gian phân tích và tiết kiệm hóa chất như: phương pháp tinh sạch PAHs bằng màng membrane, với sự kết hợp của dung môi trích ly và phương pháp phân tích bằng sắc ký khí kết hợp với khối phổ sử dụng dụng cụ trích mẫu có thể tích lớn (LVI - GC – MS) [92].
Riêng đối với thực phẩm dạng lỏng như dầu, mỡ... (sự xâm nhập PAHs do bao bì nhiễm tạp chất hoặc do còn lại hoặc bị nhiễm trong quá trình chế biến): ta có thể thực hiện quá trình phân tích PAHs gồm các bước tương tự như với mẫu rắn. Tuy nhiên các phương pháp đề cập trên thì mất nhiều thời gian và tốn nhiều dung môi do đó ít thích hợp cho các phép phân tích cần kết quả nhanh chóng. Do đó hiện nay có nhiều nghiên cứu về phương pháp phân tích PAHs ở thực phẩm dạng lỏng bằng hệ thống sắc ký cho – nhận điện tử phức tạp (DACC: donor – acceptor complex chromatography). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc: PAHs là chất cho điện tử (π
- electrons) nên chúng có tương tác mạnh với pha tĩnh là chất nhận điện tử do đó có khả năng phân tách các hợp chất PAHs cũng như là phần lớn các thành phần khác có trong dầu.
Dụng cụ: Hệ thống sắc ký cho – nhận điện tử phức tạp (DACC) gồm một cặp sắc ký lỏng LC – LC đóng vai trò cột tinh sạch DACC và một cột phân tách dùng đầu dò fluorescence để định tính và định lượng.
So với phương pháp phân tích truyền thống (sắc ký lỏng cao áp hoặc sắc ký khí) thì phương pháp DACC tiết kiệm dung môi đáng kể và thời gian chạy sắc ký cũng được rút ngắn đáng kể (tổng thời gian phân tích một mẫu là 80 phút so với 8 – 10 giờ ở phương pháp truyền thống). Hơn nữa hệ thống DACC có thể chạy sắc ký liên tục suốt 24 giờ cho phép nâng cao năng suất phân tích. Giới hạn định lượng đối với mỗi chất trong nhóm PAHs là 0.1 µg/kg. Và điều đặc biệt là phương pháp DACC sử