* Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai
Tổng cộng 16 mồi ngẫu nhiên đã đ−ợc sử đụng để phân tích cấu trúc di truyền của 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng và 14 mẫu Ngũ gia bì gai. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc hai loài Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên
Số băng đa hình/ Tổng số băng Mồi Trình tự mồi NGBH NGBG Tổng số băng tính cả 2 loài OPA 1 5’-CAGGCCCTTC-3’ 6/10 4/8 14 OPA 4 5’-GGGTAACGCC-3’ 2/6 6/9 12 OPA 5 5’-AGGGGTCTTG-3’ 0/2 0/2 2 OPA 9 5’-GGGTAACGCC-3’ 3/6 7/8 13 OPA 10 5’-GTGATCGCAG-3’ 7/9 7/8 11 OPA 12 5’-TCGGCGATAG-3’ 5/8 3/6 10 OPA 13 5’-CAGCACCCAC-3’ 4/7 7/8 9 OPA 15 5’-TTCCGAACCC- ‘ 7/10 5/10 15 OPA 17 5’-GACCGCTTGT-3’ 14/15 13/14 17 OPC 1 5’-TTCGAGCCAG-3’ 4/6 1/2 5 OPC 3 5’-GGGGGTCTTT-3’ 4/6 1/3 6 OPC 5 5’-GATGACCGCC-3’ 7/8 5/8 11 OPC 7 5’-GTCCCGACGA-3’ 7/9 3/5 9 OPC 9 5’-CTCACCGTCC-3’ 10/10 17/17 19 OPC 19 5’-GTTGCCAGCC-3’ 6/8 9/11 13 OPC 20 5’-ACTTCGCCAC-3’ 4/5 7/7 9 Tổng số (72,00%)90/125 95/126 (75,40%) 157 Trung bình 5,6/7,8 5,9/7,8 9,8
Kết quả cho thấy, tổng số băng RAPD khuếch đại đ−ợc là 157 băng,
trong đó có 125 băng xuất hiện ở loài Ngũ gia bì h−ơng và 126 băng xuất hiện
ở loài Ngũ gia bì gai, trung bình mỗi mồi khuếch đại đ−ợc 7,8 băng. Phân tích 12 mẫu thuộc loài Ngũ gia bì h−ơng xuất hiện 90 băng đa hình trong tổng số 125 băng khuếch đại đ−ợc, chiếm 72%. Đối với 14 mẫu Ngũ gia bì gai thu đ−ợc 95 băng đa hình trong tổng số 126 băng khuếch đại đ−ợc. Tức là số băng đa hình chiếm 75,4% tổng số băng. Nh− vậy các tập hợp cá thể của hai loài Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai ở Việt nam có mức độ đa hình di truyền t−ơng đối cao.
Các số liệu thu đ−ợc ở bảng 3.4 và hình 3.8 và 3.9 cũng cho thấy, trong 16 mồi ngẫu nhiên sử dụng phân tích, đa số các mồi cho kết quả thể hiện tính đa hình cao, đặc biệt là các mồi OPC9, OPA17, OPA1, OPC19. Riêng với mồi OPC9, toàn bộ 14 mẫu Ngũ gia bì gai và 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng đều cho phổ điện di sản phẩm PCR khác nhau, thể hiện sự đa hình cao của các mẫu, và đây cũng là mồi cho số băng đa hình cao nhất (19 băng). Thêm vào đó, đối với mồi OPC9, các phổ điện di cũng cho thấy sự khác biệt rõ nét giữa 2 thứ của loài Ngũ gia bì gai.
Hình3.8.ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gai bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đ−ợc khuếch đại bằng mồi OPC9
M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1 Kb, LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Tuy nhiên có một số mồi thể hiện đa hình không cao. Chẳng hạn nh− mồi OPA5 biểu hiện tính đồng hình 100% ở tất cả các mẫu nghiên cứu thuộc cả hai loài. Đây cũng là mồi cho số băng RAPD-PCR ít nhất trong số 16 mồi phân tích. Với tất cả các mẫu chỉ thu đ−ợc 2 băng đồng hình (hình 3.9).
Kết quả phân tích cho thấy, mặc dù loài Ngũ gia bì h−ơng chỉ còn tập hợp một số ít nhóm các cá thể nh−ng mức độ đa dạng di truyền của loài này cũng khá cao (xem phụ lục 12). Ngoại trừ mồi OPA5, hầu hết các mồi đều xuất hiện các băng đa hình. Điều này chứng tỏ Ngũ gia bì h−ơng có nhiều kiểu di truyền khác nhau và việc bảo tồn các quần thể còn xót lại là hết sức cần thiết.
Còn đối với loài Ngũ gia bì gai, mức độ đa dạng di truyền đối với các mẫu ở các địa ph−ơng khác nhau cũng khác nhau (xem phụ lục 13). Các mẫu quần thể ở hai tỉnh Lào Cai và Cao Bằng có mức độ đa dạng di truyền cao hơn so với các mẫu thu tại Lạng Sơn. Số băng đa hình trung bình thu đ−ợc từ các mẫu ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn lần l−ợt là 4,3; 4,1 và 2,8 băng trên tổng số băng trung bình thu đ−ợc là 7,8 băng. Sự đa dạng di truyền của loài Ngũ gia bì gai ở các địa ph−ơng thu thập mẫu (Lào Cai, Cao Bằng và
Hình3.9.ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đ−ợc khuếch đại bằng mồi OPA5
M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1 Kb; LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 5) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Lạng Sơn) còn đ−ợc thể hiện qua việc không tìm thấy một chỉ thị RAPD-PCR đồng hình nào xét trong từng nhóm mẫu đ−ợc thu thập tại mỗi địa ph−ơng.
Xử lý số liệu bằng phần mềm NTSYS-pc 2.02h, đã xác định đ−ợc hệ số t−ơng đồng di truyền (bảng 3.5) và xây dựng đ−ợc sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa 14 mẫu Ngũ gia bì gai và 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng (hình 3.10). Từ sơ đồ hình cây quan hệ di truyền, có thể nhận thấy sự khác biệt khá rõ về
cấu trúc di truyền giữa hai loài Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai. Các mẫu
thuộc hai loài tách thành hai nhóm rõ rệt, với hệ số khoảng cách di truyền giữa chúng là khoảng 0,5. Trong phạm vi mỗi loài, hệ số t−ơng đồng di truyền giữa các mẫu cũng cho thấy tính đa dạng di truyền t−ơng đối cao ở mỗi loài. Hệ số này giữa các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai dao động từ 0,62 đến 0,92, còn đối với các mẫu Ngũ gia bì h−ơng là từ 0,67 đến 0,95.
Đối với loài Ngũ gia bì h−ơng, các cặp mẫu có hệ số t−ơng đồng di truyền cao nhất (0,95) là giữa cặp mẫu HHG1 và HHG2 (đều thu ở Hà Giang), và
cặp mẫu HLC1 (thu ở Lào Cai) và HHG4 (thu ở Hà Giang). Các mẫu thu thập
đ−ợc có tính đa hình t−ơng đối cao. Dựa vào Cây quan hệ di truyền cho thấy, các cá thể Ngũ gia bì h−ơng phân thành 3 nhóm tách biệt về cấu trúc di truyền. Nhóm thứ nhất bao gồm các mẫu HLC4, HLC5 và HLC6 (tất cả đều đ−ợc thu ở Lào Cai). Nhóm thứ hai gồm các mẫu HLC7, HLC8, HLC1 và HHG4 (gồm 3 mẫu thu ở Lào Cai, và 1 mẫu thu ở Hà Giang). Nhóm thứ ba gồm các mẫu HLC2, HLC3, HHG1, HHG2 và HHG3 (gồm 2 mẫu thu ở Lào Cai, và 3 mẫu thu ở Hà Giang). Kết quả này cho thấy có thể có sự liên hệ nào đó về nguồn gốc của các mẫu Ngũ gia bì H−ơng thu ở Lào Cai và Hà giang. Mặt khác, khi xét trong phạm vi các mẫu Ngũ gia bì h−ơng thu ở Lào Cai, chúng tôi nhận thấy chúng phân tách thành hai nhóm. Một nhóm tách biệt gồm 3 mẫu thu ở Lào Cai là HLC4, HLC5 và HLC6. Nhóm các mẫu thu ở Lào Cai còn lại (HLC1, HLC2, HLC3, HLC7 và HLC8) có cấu trúc di truyền gần hơn với các mẫu thu ở Hà Giang.
Điều này cũng hoàn toàn phù hợp vì các mẫu này có nguồn gốc từ Hà Giang (lấy nguyên liệu từ Hà Giang về nhân giống và trồng ở Lào Cai).
Khi so sánh giữa các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai có địa điểm phân bố gần nhau t−ơng ứng tại các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn, hệ số t−ơng đồng di truyền của các mẫu t−ơng ứng là 0,78; 0,69 và 0,84. Trong số đó, hai mẫu thể hiện tính đồng hình lớn nhất (hệ số t−ơng đồng di truyền 0,92)
là GLS1 và GLS2. Hai mẫu này đều đ−ợc thu ở huyện Tràng Định, tỉnh Lạng
Sơn. Hai mẫu có sự khác biệt di truyền lớn nhất (hệ số t−ơng đồng di truyền 0,62) là hai mẫu GCB2 (thu ở Cao Bằng) và GLC6 (thu ở Lào Cai). Từ cây quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai (hình 3.10), cũng có thể nhận thấy không có sự t−ơng đồng rõ rệt về hệ số t−ơng đồng di truyền giữa các mẫu và địa điểm phân bố của chúng. Nhìn chung, các cá thể thu ở tỉnh Lào Cai và Cao Bằng thể hiện tính đa hình di truyền cao hơn so với các cá thể thu ở tỉnh Lạng Sơn. Kết quả cho thấy, các quần thể Ngũ gia bì gai ở mỗi địa ph−ơng có thể có nhiều nguồn gốc di truyền khác nhau t−ơng ứng với mức độ đa dạng di truyền trong chúng.
58
Bảng 3.5. Hệ số t−ơng đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G)
GLC1 GLC5 GCB1 GCB2 GLS1 GLS2 GLS3 GLS4 GLS5 GCB3 GLC6 GLC2 GLC3 GLC4 HLC4 HLC5 HLC6 HLC7 HLC8 HLC1 HHG4 HLC2 HLC3 HHG1 HHG2 HHG3 GLC1 1.00 GLC5 0,91 1,00 GCB1 0,87 0,87 1,00 GCB2 0,66 0,67 0,65 1,00 GLS1 0,83 0,82 0,87 0,70 1,00 GLS2 0,83 0,84 0,84 0,65 0,92 1,00 GLS3 0,82 0,84 0,79 0,63 0,82 0,89 1,00 GLS4 0,78 0,78 0,74 0,71 0,84 0,83 0,88 1,00 GLS5 0,82 0,82 0,81 0,67 0,78 0,77 0,85 0,86 1,00 GCB3 0,80 0,76 0,77 0,66 0,84 0,78 0,76 0,80 0,84 1,00 GLC6 0,79 0,76 0,72 0,62 0,80 0,78 0,77 0,80 0,76 0,86 1,00 GLC2 0,77 0,77 0,73 0,71 0,78 0,74 0,75 0,82 0,81 0,83 0,82 1,00 GLC3 0,76 0,73 0,71 0,66 0,76 0,80 0,81 0,82 0,79 0,80 0,80 0,79 1,00 GLC4 0,77 0,78 0,74 0,70 0,76 0,75 0,74 0,75 0,73 0,75 0,73 0,79 0,77 1,00 HLC4 0,48 0,48 0,47 0,43 0,51 0,47 0,47 0,51 0,48 0,52 0,52 0,53 0,52 0,53 1,00 HLC5 0,49 0,50 0,52 0,39 0,53 0,47 0,47 0,48 0,49 0,48 0,47 0,49 0,48 0,51 0,84 1,00 HLC6 0,50 0,48 0,50 0,42 0,52 0,48 0,48 0,52 0,50 0,49 0,48 0,53 0,52 0,53 0,86 0,83 1,00 HLC7 0,47 0,47 0,46 0,43 0,45 0,42 0,44 0,44 0,47 0,46 0,47 0,48 0,46 0,50 0,67 0,69 0,67 1,00 HLC8 0,49 0,48 0,49 0,42 0,47 0,44 0,47 0,48 0,48 0,48 0,48 0,50 0,50 0,50 0,75 0,70 0,72 0,86 1,00 HLC1 0,49 0,48 0,51 0,42 0,50 0,48 0,48 0,52 0,48 0,48 0,49 0,50 0,53 0,50 0,75 0,74 0,74 0,79 0,92 1,00 HHG4 0,49 0,51 0,51 0,42 0,52 0,49 0,48 0,52 0,48 0,50 0,51 0,50 0,53 0,52 0,78 0,77 0,74 0,78 0,89 0,95 1,00 HLC2 0,52 0,53 0,53 0,44 0,52 0,50 0,52 0,52 0,56 0,56 0,55 0,57 0,54 0,56 0,75 0,71 0,70 0,67 0,74 0,74 0,76 1,00 HLC3 0,56 0,53 0,53 0,44 0,52 0,51 0,55 0,54 0,57 0,55 0,53 0,57 0,55 0,56 0,70 0,68 0,67 0,67 0,74 0,76 0,76 0,94 1,00 HHG1 0,53 0,53 0,50 0,44 0,50 0,47 0,51 0,50 0,56 0,57 0,54 0,54 0,54 0,55 0,70 0,68 0,67 0,70 0,70 0,70 0,70 0,90 0,90 1,00 HHG2 0,53 0,54 0,51 0,46 0,52 0,49 0,52 0,52 0,55 0,57 0,56 0,56 0,55 0,57 0,71 0,70 0,69 0,72 0,73 0,76 0,76 0,84 0,84 0,95 1,00 HHG3 0,51 0,53 0,49 0,46 0,52 0,50 0,51 0,54 0,52 0,53 0,55 0,57 0,54 0,56 0,73 0,69 0,7 0,68 0,71 0,74 0,74 0,84 0,82 0,92 0,93 1,00
59 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G)
LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
GLC1 GLC5 GCB1 GLS1 GLS2 GLS3 GLS4 GLS5 GCB3 GLC6 GLC2 GLC3 GLC4 GCB2 HLC4 HLC5 HLC6 HLC7 HLC8 HLC1 HHG4 HLC2 HLC3 HHG1 HHG2 HHG3 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Hệ số tương đồng di truyền 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Kết quả phân tích ở trên cho thấy, mặc dù hai loài cây thuốc Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì h−ơng ở n−ớc ta có phạm vi phân bố không rộng lắm, nh−ng tính đa hình di truyền trong các nhóm cá thể hiện có là t−ơng đối đa dạng. Vì vậy, vấn đề bảo tồn đ−ợc tính đa dạng di truyền của hai loài cây thuốc quý này là thực sự cần thiết. Tuy nhiên, để có thể có đ−ợc những cơ sở dữ liệu đầy đủ và hoàn thiện hơn về hai loài cây thuốc này, cần tiếp tục mở rộng quy mô nghiên cứu lớn hơn cả về địa điểm thu mẫu và số l−ợng mẫu phân tích.
* Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Tổng cộng 13 mồi ngẫu nhiên đã đ−ợc sử đụng để phân tích cấu trúc di truyền của 20 mẫu Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. Danh sách mồi, trình tự, tổng số băng đ−ợc khuếch đại và số băng đa hình của mỗi loài đ−ợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên
Số băng đa hình/Tổng số băng Mồi Trình tự mồi SVD TTH Tổng số băng tính cả 2 loài OPA1 5-CAGGCCCTTC-3’ 1/7 3/7 9 OPA2 5’-TGCCCAGCTG-3’ 0/6 1/6 6 OPA3 5’-AGTCAGCCAC-3’ 0/2 2/4 4 OPA7 5’-GAAACGGGTC-3’ 2/4 0/3 5 OPA8 5’-GTGACGTAGG-3’ 0/4 3/7 7 OPA12 5’-TCGGCGATAG-3’ 1/9 0/9 9 OPA14 5’-TCTGTGCTGG-3’ 2/8 1/6 9 OPC1 5’-TTCGAGCCAG-3’ 0/4 0/4 4 OPC6 5’-GAACGGACTC-3’ 4/6 5/5 9 OPC12 5’-TGTCATCCCC-3’ 4/7 0/6 10 OPC15 5’-GACGGATCAG-3’ 1/3 1/2 5 OPC16 5’-CACACTCCAG-3’ 0/7 1/8 13 OPC17 5’-TTCCCCCCAG-3’ 4/6 3/6 11 Tổng số 19/73 (26,0%) 20/73 (27,4%) 101 Trung bình 1,5/5,6 1,5/5,6
Kết quả thu đ−ợc cho thấy có 101 băng khuếch đại, trong đó tổng số băng khuếch đại của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cùng là 73 băng. Trung bình mỗi mồi khuếch đại đ−ợc 5,6 băng. Phân tích 12 mẫu thuộc loài Sâm vũ diệp chỉ xuất hiện 19 băng đa hình trong tổng số 73 băng khuếch đại, chiếm 26,0%. Đối với 8 mẫu Tam thất hoang, thu đ−ợc 20 băng đa hình trong tổng số 73 băng khuếch đại, chiếm 27,4% tổng số băng. Nh− vậy, các tập hợp cá thể của hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt nam có mức độ đa hình di truyền không cao. Cả hai loài này đều có đặc điểm chung là tính đồng hình thể hiện rất rõ (hình 3.11và hình 3.12).
Hình 3.11. Băng đồng hình của các mẫu Sâm vũ diệp (V) và dạng lá xẻ nông (VT) t−ơng ứng với mồi OPC1
Các chữ số (1 - 5) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Hình 3.12. Băng đồng hình của các mẫu Tam thất hoang (T) t−ơng ứng với mồi OPA7
Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
OPC1 M VT1 VT2 V1 V2 V3 V4 V5 bp 1000 750 600 250 200 OPA7 bp 750 600 250 M T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Kết quả phân tích các phổ băng điện di RAPD-PCR của các mẫu dạng lá xẻ nông có sự t−ơng đồng đáng kể với các mẫu Sâm vũ diệp (hình 3.13). Kết quả này cũng góp phần xác định các cá thể có kiểu hình lá xẻ nông thuộc loài Sâm vũ diệp chứ không phải loài Tam thất hoang.
Hình 3.13.ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Sâm vũ diệp (V), dạng lá xẻ nông (VT) và Tam thất hoang (T) đ−ợc khuếch đại bằng mồi OPA8
Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Phổ băng điện di thu đ−ợc cũng cho thấy cấu trúc di truyền của hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có sự t−ơng đồng lớn, thể hiện quan hệ gần gũi giữa hai loài.
Sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng tôi đã xây dựng đ−ợc bảng hệ số t−ơng đồng di truyền (bảng 3.7) và cây quan hệ di truyền giữa 12 mẫu Sâm vũ diệp và 8 mẫu Tam thất hoang (hình 3.14). Với các mẫu Sâm vũ diệp (bao gồm cả dạng lá xẻ nông), hệ số t−ơng đồng di truyền dao động từ 0,89 đến 1,00, trong đó mẫu V2 có cấu trúc di truyền hoàn toàn giống mẫu V3, t−ơng tự với hai mẫu V5 và V6. Cấu trúc di truyền khác nhau nhất là của các mẫu V2, V3 ,V4 với V7 và giữa mẫu VT1 với mẫu VT3. ở tr−ờng hợp các mẫu
Tam thất hoang, hệ số t−ơng đồng di truyền thấp nhất thu đ−ợc giữa mẫu T8
với T1 và T2 (0,89) còn hệ số t−ơng đồng di truyền cao nhất là giữa T1 và T2 (1,00). Có thể nhận thấy, ở cả hai loài cây thuốc này, hệ số t−ơng đồng di
truyền giữa các mẫu trong loài là khá cao, thể hiện tính đồng hình t−ơng đối cao trong và giữa các quần thể của mỗi loài. Kết quả này phù hợp với thực tế