M ột vớ dụ tuyệt vời cho trường hợp này là bệnh hồng cầu hỡnh liềm
4. Tổng hợp DNA lấp cả hai khoảng trống (cỏc sọc xanh) nhờ sử dụng cả hai sợi của chromatid 2 (đỏ) làm khuụn.
nhờ sử dụng cả hai sợi của chromatid 2 (đỏ) làm khuụn.
Tất cả cỏc sợi được cắt và cỏc đầu mỳt bị cắt của một chromatid được trao đổi và nối lại bằng liờn kết đồng hoỏ trị với cỏc đầu mỳt bị cắt của chromatid khỏc. Nếu
điều này xảy ra, cỏc chromatid khụng chị em sẽ cú cỏc vai trao đổi và trao đổi chộo là hoàn toàn (phớa dưới).
Hỡnh 5.21 Con đường tỏi tổ hợp tương đồng với sự tham gia của cỏc protein tỏi tổ hợp RecBCD. Đầu tiờn, RecBCD tạo cỏc vết đứt; sau đú cỏc protein RecA và SSB xỳc tiến sự xõm nhập sợi, tạo ra bắt chộo hay là chỗ nối Holliday; RuvA và B thỳc đẩy sự di chuyển theo nhỏnh bờn; RuvC tạo cỏc vết nứt làm dung giải cấu trỳc này thành ra cỏc DNA tỏi tổ hợp.
3.2. Đại cương về cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp
plasmid và việc sử dụng chỳng để tạo ra cỏc phõn tử DNA tỏi tổ hợp in vitro trong những năm đầu của thập niờn 1970 là cơ sở cho sự ra đời của
cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp (recombinant DNA technology).
Dưới đõy chỳng ta chỉ tỡm hiểu sơ lược về cỏc enzyme giới hạn và vector - những cụng cụ thiết yếu của kỹ thuật di truyền, phương phỏp cơ
bản của việc xõy dựng DNA tỏi tổ hợp in vitro và một quy trỡnh đơn giản về sự tạo dũng gene ở vi khuẩn và một sốứng dụng của nú.
3.2.1. Cỏc enzyme giới hạn (restriction endonuclease)
Cụng trỡnh nghiờn cứu đầu tiờn của Daniel Nathan và Hamilton Smith năm 1969 ở Haemophilus influenzae xỏc nhận cỏc tế bào vi khuẩn là những hệ thống chứa cỏc enzyme sửa đổi và enzyme giới hạn (Hỡnh 8.2). Cỏc enzyme đều cú đối tượng nhận biết là cỏc đoạn trỡnh tự DNA vật chủ
và DNA ngoại lai, nhưng cú vai trũ khỏc nhau. Cỏc enzyme sửa đổi
(methylase) đúng vai trũ bảo vệ DNA vật chủ bằng cỏch gắn thờm nhúm methyl ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đớch
(recognition/target sequence), trong khi cỏc enzyme giới hạn (restriction endonuclease) đúng vai trũ vụ hiệu hoỏ hoạt tớnh của cỏc DNA lạ bằng cỏch phõn cắt ở cỏc vị trớ đặc thự(Hỡnh 5.22). (a) (b) Cỏc vị trớ được bảo vệ DNA phage bị cắt đoạn NSTvi khuẩn Enzyme giới hạn
Hỡnh 5.22 (a) D.Nathan (trỏi) và H.Smith. (b) Enzyme giới hạn cắt vụn DNA của phage lạ khi nú xõm nhập vào tế bào vi khuẩn.
* Danh phỏp và tớnh chất của cỏc enzyme giới hạn
- Cỏc enzyme giới hạn chỉ phỏt hiện được ở cỏc vi khuẩn vỡ vậy, tờn gọi của cỏc enzyme giới hạn được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cỏi viết tắt của vi khuẩn mà từđú enzyme được chiết xuất. Chữ cỏi đầu tiờn được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cỏi tiếp theo viết thường để chỉ loài
(species), và nếu cần thờm chữ cỏi thứ tư để chỉ nũi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phõn biệt cỏc enzyme của cựng một nũi dựng thờm số
La Mó kốm theo sau (xem Bảng 5.3).
trớ, nghĩa là chỳng cú thể nhận biết và cắt tại trỡnh tự DNA đặc thự.
- Đoạn đớch là cú kớch thước ngắn 4-8 cặp base và cú tớnh đối xứng xuụi ngược (palindrome).
- Cỏc enzyme giới hạn khỏc nhau cú hai kiểu cắt: cắt lệch và cắt thẳng. Với kiểu cắt lệch, tạo ra cỏc đoạn DNA cú cỏc đầu sợi đơn bổ sung gọi là cỏc đầu dớnh (cohesive/sticky ends); vớ dụ EcoRI. Với kiểu cắt thẳng, tức cắt cựng vị trớ trờn cả hai sợi của DNA sợi kộp, tạo ra cỏc đoạn DNA cú cỏc đầu bằng (blunt ends); vớ dụ AluI (Bảng 5.3).
Bảng 5.3 Cỏc trỡnh tự nhận biết và vị trớ cắt của cỏc enzyme giới hạn được chọn lọc (mũi tờn chỉ vị trớ cắt; cỏc trỡnh tự ở đõy được chỉ ra trờn sợi 5'→3')
Nguồn vi sinh vật Tờn enzyme Trỡnh tự nhận biết
Arthrobacter luteus AluI AG↓CT
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC
Escherichia coli RY13 EcoRI G↓AATTC
Haemophilus influenzae Rd HindII GTPy↓PuAC
Haemophilus influenzae Rd HindIII A↓AGCTT
Nocardia otitidis-caviarum NotI GC↓GGCCGC
Providencia stuartii PstI CTGCA↓G
Serratia marcescens SmaI CCC↓GGG
Xanthomonas malvaccarum XmaI C↓CCGGG
Bờn cạnh cỏc enzyme giới hạn, cũn cú cỏc enzyme khỏc thuộc ba nhúm sau đõy được sử dụng trong lĩnh vực cụng nghệ này: (i) Cỏc
polymerase: DNA polymerase và RNA polymerase, kể cả reverse transcriptase; (ii) Cỏc ligase: DNA ligase và RNA ligase; và (iii) Cỏc
nuclease: DNase và RNase. 3.2.2. Cỏc vector
DNA tỏi tổ hợp (recombinant DNA) là phõn tử DNA được tạo ra trong
ống nghiệm bằng cỏch kết hợp cỏc DNA từ cỏc nguồn khỏc nhau, theo một quy trỡnh kỹ thuật nhất định (gọi là kỹ thuật tỏi tổ hợp DNA).
Thụng thường một phõn tử DNA tỏi tổ hợp bao gồm một phõn tử DNA cú bản chất là plasmid hoặc phage nguyờn vẹn gọi là vector (thể tải) và một đoạn DNA từ nguồn khỏc mang một gene hoặc yếu tốđiều hũa mong muốn được cho xen vào gọi là DNA ngoại lai (foreign DNA).
Trong số cỏc vector, cỏc plasmid của vi khuẩn được sử dụng rộng rói hơn cả, nhờ cú cỏc đặc điểm sau: (i) Mỗi plasmid là một phõn tử DNA sợi kộp thường ở dạng vũng và chỉ cú một khởi điểm tỏi bản riờng; (ii) Cú khả
năng xõm nhập vào tế bào vật chủ và hoạt động bỡnh thường; (iii) Cú kớch thước bộ, thường chỉ vài ngàn cặp base nờn dễ dàng tinh chiết; (iv) Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khỏ cao; (v) Một số plasmid cú chứa cỏc gene khỏng thuốc tiện lợi cho việc theo dừi và phỏt hiện sự cú mặt của plasmid tỏi tổ hợp trong vi khuẩn chủ (Hỡnh 5.23).
EcoRI Sal I gene khỏng ampicillin gene khỏng tetracycline Pst I ori pBR322
Hỡnh 5.23 Cỏc plasmid pBR322 và pUC19. Ởđõy cho thấy kớch thước, khởi
điểm (Ori) và cỏc vựng chứa gene khỏng ampicillin (AmpR) và tetracyclin (TetR)... cũng như vị trớ cắt của một số enzyme giới hạn trong cỏc vựng này.
3.2.3. Xõy dựng phõn tử DNA tỏi tổ hợp in vitro
Bất kỳ đoạn DNA nào nếu được cắt bởi cựng một loại enzyme giới hạn (vớ dụ, EcoRI) cho cỏc đầu dớnh thỡ cú thể bổ sung với nhau và được nối bởi DNA ligase (hỡnh 5.24). Phương phỏp thành lập phõn tử DNA tỏi tổ hợp kiểu này lần đầu tiờn được đưa ra bởi J.Mert và R.Davis năm 1972 bằng thực nghiệm trờn cỏc virus. Và sau đú, lần đầu tiờn năm 1973, H.Boyer và nhúm nghiờn cứu của S.Cohen đó tạo ra được phõn tử DNA tỏi tổ hợp gồm vector là plasmid nhỏ pSC101 của E. coli và DNA ''ngoại
lai'' là một plasmid khỏc. Chớnh sự kiện này đó đặt nền múng và mở ra triển vọng to lớn cho kỹ thuật DNA tỏi tổ hợp sau này.
3.2.4. Tạo dũng gene ở vi khuẩn
Về nguyờn tắc, kỹ thuật DNA tỏi tổ hợp hay tạo dũng (cloning) gồm cỏc bước chung nhất như sau: (1) Tỏch chiết và tinh sạch DNA thuộc cỏc nguồn khỏc nhau (gồm vector và DNA mang gene mong muốn); (2) Kiến tạo phõn tử DNA tỏi tổ hợp in vitro; (3) Đưa phõn tử DNA tỏi tổ hợp vào trong tế bào nhận, thường là E. coli hoặc nấm men; và (4) Phỏt hiện và phõn lập cỏc dũng DNA tỏi tổ hợp đặc hiệu. gene AmpR DNA ng-ời gene insulin đầu dính Biến nạp
Đặt các vi khuẩn lên môi tr-ờng có bổ sung ampicilline Chỉ có các vi khuẩn chứa DNA t i tổ hợp sinh tr-ởng Nuôi cấy Tinh chiết DNA gene TetR Tạo dòng Dòng
Hỡnh 5.24Tạo dũng vi khuẩn mang DNA tỏi tổ hợp cú chứa gene insulin người.
Trong tế bào chủ, phõn tử DNA tỏi tổ hợp cú thể biểu hiện gene mong muốn hoặc tỏi bản độc lập nhiều lần để tạo ra hàng loạt bản sao của nú, và khi tế bào chủ phõn chia sẽ kộo theo hiện tượng tạo dũng (cloning). Mặt khỏc, do tốc độ phõn chia rất nhanh của cỏc vi khuẩn nờn cú thể tạo
hàng triệu bản sao mong muốn. Vỡ thế nhà khoa học cú thể tỏch dũng bất kỳ một gene nào dựng để nghiờn cứu hoặc sản xuất trờn quy mụ cụng nghiệp một số lượng lớn cỏc protein vốn là những chế phẩm y-sinh học nào đú.
Hỡnh 5.24 giới thiệu một quy trỡnh kỹ thuật tạo dũng ở vi khuẩn mang gene insulin người. Việc phỏt hiện DNA tỏi tổ hợp dựa trờn khả năng khỏng thuốc do vector plasmid mang lại (chứa hai gene khỏng AmpR và TetR; và giả thiết gene TetR cú chứa điểm cắt của EcoRI).
Một số sản phẩm được tạo dũng ở vi khuẩn liờn quan đến cỏc ứng dụng khỏc nhau trong điều trị bệnh ở người được giới thiệu ở bảng 5.4. [Về chi tiết, cú thể xem trong cỏc giỏo trỡnh Cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp
do Nguyễn Hoàng Lộc chủ biờn; Di truyền vi sinh vật và ứng dụng do Hoàng Trọng Phỏn chủ biờn, NXB Đại học Huế - 2006.]
Bảng 5.4 Cỏc sản phẩm sinh ra thụng qua cỏc vi khuẩn chứa cỏc gene người được tạo dũng
Sản phẩm Áp dụng
Cỏc interferon Dựng để điều trị cỏc bệnh lõy nhiễm virus và ung thư Interleukin 2 Kớch thớch hệ thống miễn dịch và cú thể dựng trong
điều trị ung thư và cỏc rối loạn hệ thống miễn dịch Insulin Được dựng để điều trị bệnh tiểu đường
Somatotropin Được dựng để điều trị dị tật lựn thuộc về tuyến yờn Chất kớch hoạt Làm tan cỏc cục đụng mỏu cho điều trị và ngăn chặn plasminogen cỏc tỡnh trạng tắc nghẽn tim mạch
Nhõn tố hoại tử khối u Tấn cụng và giết cỏc khối u ung thư Cỏc nhõn tố XI và VIII Được dựng để điều trị bệnh mỏu khú đụng
Erythropoietin Kớch thớch tạo cỏc tế bào hồng cầu cho điều trị bệnh thiếu mỏu (anemia)
Beta endorphin Cỏc chất giảm đau tự nhiờn do cơ thể tạo ra; cú thể được dựng làm thuốc giảm đau
Cỏc enzyme Được dựng rộng rói từ việc điều khiển cỏc phản ứng hoỏ học trong cỏc quỏ trỡnh kỹ nghệ cho đến việc bổ sung cỏc enzyme trong khẩu phần ăn của người Cỏc vaccine tiểu đơn vị Kớch thớch khả năng miễn dịch của cơ thể đối với
một hoặc hai khỏng nguyờn then chốt của một tỏc nhõn gõy bệnh; giảm nguy cơ rủi ro của cỏc vaccine thụng thường