Tảo được lưu giữđể cung cấp cho các thí nghiệm bằng phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, đặt ởđiệu kiện phòng thí nghiệm. Đựng trong bình 250mL ở ánh sáng yếu (1000 đến 1500 lux), không sục khí, với môi trường Walne.
- Lưu giữ môi trường thạch: Pha 2g agar với 100 ml nước biển trong bình tam giác 500mL, bổ sung môi trường dinh dưỡng (được chọn ở thí nghiệm 1) không cho vitamin, độ mặn: chọn ở thí nghiệm 2. Sau đó, Autoclarve ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1.5 at trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống thấp hơn 80oC lấy các dụng cụ nuôi ra và để nguội khoảng 20 phút và cho vitamin vào đồng thời đổ vào đĩa petri.
Sau 12 giờ, khi thạch đông, nguội, cấy chuyền tảo lên bề mặt thạch. Đậy nắp lại, đặt dưới dàn đèn neon (thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày). Cường độ ánh sáng được chọn ở thí nghiệm 4.
Sau khi (4 - 6 ngày) thấy xuất hiện các quần lạc tảo trên bề mặt thạch đưa đĩa petri đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ 7 - 8oC để lưu giữ.
- Lưu giữ môi trường bán lỏng: Pha 2g agar với 100 ml nước biển trong bình tam giác 500mL, bổ sung môi trường dinh dưỡng (được chọn ở thí nghiệm 1) không cho vitamin, độ mặn: chọn ở thí nghiệm 2. Sau đó, Autoclarve ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1.5 at trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống thấp hơn 80oC lấy các dụng cụ nuôi ra và để nguội khoảng 20 phút và cho vitamin vào đồng thời đổ vào bình tam giác 250mL khoảng 80mL
Sau 12 giờ, khi thạch đông, nguội, cho 100ml nước nuôi và tảo vào nuôi, mật độ ban đầu được chọn ở thí nghiệm 3, đặt dưới dàn đèn neon (thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày) cường độ ánh sáng được chọn ở thí nghiệm 4. Tảo được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo tốt nhất, cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 7 - 8 oC để lưu giữ.
- Lưu giữ môi trường lỏng: tảo được nuôi ở bình tam giác 250mL, mật độ ban đầu được chọn ở thí nghiệm 3, đặt dưới dàn đèn neon (thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày) cường độ ánh sáng được chọn ở thí nghiệm 4. Tảo được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo tốt nhất, cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 7 - 8 oC để lưu giữ.
2.4.2.1. Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện lưu giữ thích hợp
Theo kết quả nghiên cứu về lưu giữ vi tảo trong các thang nhiệt độ khác nhau của Lê Viễn Chí [2], Hoàng Thị Bích Mai [11], Nguyễn Thị Xuân Thu [13] cho thấy, ở nhiệt độ cận với nhiệt độ thích hợp của tảo, tảo thường kém phát triển ở các lô thí nghiệm có nhiệt độ thấp hơn ngưỡng nhiệt độ thích hợp. Khi ở nhiệt độ 7 - 10OC sẽ làm chậm quá trình trao đổi chất của tế bào, quá trình sinh trưởng và sinh sản của tảo bịđình trệ [28]. Vì thế, chúng tôi đã chọn thang nhiệt độ có giá trị thấp (7 - 8oC), để thí nghiệm lưu giữ trong nghiên cứu của đề tài. Phương pháp này đơn giản, đỡ tốn kinh phí và công nuôi cấy. Tảo nuôi ở bình tam giác được thu ở cuối pha logarit và lưu giữở các môi trường nuôi khác nhau sau đó cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 7 - 8oC. Thí nghiệm lặp lại 5 lần. Chỉ tiêu đánh giá: mật độ cực đại.
Bảng 2.2 Các nghiệm thức xác định môi trường nuôi lưu giữ thích hợp đối với tảo
Tetraselmis suecica
Lô Thí nghiệm Điều kiện lưu giữ
Lô 1 Lô 2 Lô 3
Nhiệt độ 7 - 8oC
Môi trường nuôi Lỏng Bán lỏng Agar
Thời gian 3 tuần
Sau 2 tuần lưu giữở các điều kiện khác nhau (bảng 2.2) đưa tảo ra và tiến hành nuôi sinh khối ở các bình thủy tinh có thể tích 1lít, với:
Mật độ ban đầu: chọn ở thí nghiệm 3
Môi trường dinh dưỡng: chọn ở thí nghiệm 1 Độ mặn: chọn ở thí nghiệm 2
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày Nhiệt độ: 24 - 25oC
Đánh giá sự phát triển mật độ cực đại của tảo trong các bình thí nghiệm để tìm được môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp. Ngoài ra, còn xác định dịch nuôi dạng lỏng, bán lỏng có phù hợp để lưu giữ tảo Tetraselmis suecica hay không. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Các lô thí nghiệm dịch nuôi lỏng và bán lỏng đưa tảo ra để dưới điều kiện ánh sáng yếu (1000 - 1500 lux) trong khoảng 3 - 4 giờ sau đó dùng tảo để bố trí thí nghiệm.
Các lô thí nghiệm dịch nuôi agar lấy mẫu từ quần lạc chuyển qua nuôi trong các bình tam giác (có thể tích 250mL) đã pha sẵn môi trường dinh dưỡng để dưới điều kiện ánh sáng (1.000 -1.500 lux) trong khoảng 3 - 4 giờ sau đó dùng tảo để bố trí thí nghiệm.
2.4.2.2. Thí nghiệm 6: Xác định thời gian lưu giữ vi tảo thích hợp
Chọn nhiệt độ lưu giữ và dạng môi trường nuôi thích hợp (xác định từ các thí nghiệm trên) cho tảo. Sau đó, tiến hành bố trí 3 lô thí nghiệm lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau (4 tuần, 6 tuần và 8 tuần). Mật độ lưu giữ: 250 - 300 x 104 tb/mL. Sau đó, đưa tảo được lưu giữ như trên ra nuôi sinh khối trong các bình thủy tinh có thể tích 1 lít.
Điều kiện nuôi: Mật độ ban đầu: chọn ở thí nghiệm 3
Môi trường dinh dưỡng: chọn ở thí nghiệm 1 Độ mặn: chọn ở thí nghiệm 2
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày Nhiệt độ: 24 - 25oC
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.