2.1.1Nguyên liệu đầu cá Mĩ
Đầu cá Mĩ được mua tại cơng ty TNHH Tín Thịnh thuộc Khu Cơng Nghiệp Suối Dầu, Khánh Hịa. Đầu cá được đơng lạnh sau đĩ vận chuyển về phịng thí nghiệm Cơng nghệ chế biến, Đại học Nha Trang. Tại đây, đầu cá Mĩ được xử lý và xay nhỏ bằng máy xay. Nguyên liệu được bao gĩi trong các túi PE và bảo quản trong tủ đơng ở nhiệt độ - 200C cho đến khi sử dụng.
Hình 2.1. Nguyên liệu đầu cá Mĩ 2.1.2. Enzyme Protamex [5]
Enzyme Protamex sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm được mua tại cơng ty Novozyme Tp. Hồ Chí Minh. Chế phẩm cĩ dạng bột màu nâu sáng, kích thước hạt khoảng 250 - 450 micro, dễ hịa tan trong nước, cĩ hoạt độ 1,5 Anson Unit (AU/g), là một loại enzyme endoprotease cĩ hoạt độ cao. Được thu từ chủng vi sinh vật Bacillus.
Enzyme Protamex bị ức chế trong 15 phút ở 850C (1850F) hoặc ở pH bằng 8. Cũng cĩ thể ức chế enzyme bằng các loại axít như axít tricloacetic,
Đầu cá Mĩ Xay nhỏ
Kết quả và thảo luận
Xác định các thành phần sinh hĩa:Nước, protein, lipit,tro.
clohidric, photphoric, malic, lactic hoặc axít acetic. Tuy nhiên, ức chế enzyme cịn phụ thuộc nhiều vào nồng độ enzyme, pH…
Hoạt động tối ưu của enzyme Protamex là pH = 5,5 – 7,5. Nhiệt độ 35 – 600C (95 – 1400F).
Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào nhiệt độ bảo quản. Enzyme Protamex được bảo quản ở nhiệt độ 50C (410F). Tại nhiệt độ enzyme duy trì hoạt độ ít nhất là một năm. Nếu bảo quản ở 250C (770F) thì enzyme duy trì được hoạt động ít nhất là 3 tháng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định thành phần hĩa học của đầu cá Mĩ
Xác định thành phần hĩa học của nguyên liệu đầu cá Mĩ được thực hiện theo sơ đồ sau:
Sơ đồ:
Hình 2.2. Sơ đồ xác định thành phần hĩa học của đầu cá Mĩ
2.2.2. Thí nghiệm xác định các thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu cá Mĩ bằng enzyme Protamex phân đầu cá Mĩ bằng enzyme Protamex
- Bố trí thí nghiệm theo phương pháp cổ điển.
- Các thơng số cố định: pH tự nhiên, tỷ lệ nước/nguyên liệu. - Các thơng số cần nghiên cứu:
+ Nhiệt độ thủy phân; + Thời gian thuỷ phân;
- Các chỉ tiêu để chọn thơng số thích hợp là độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ và nitơ amoniac.
2.2.2.1. Quy trình dự kiến sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá Mĩ Sơ đồ:
Hình 2.3. Quy trình dự kiến sản xuất dịch đạm thủy phân từ đầu cá Mĩ. Thuyết minh quy trình:
- Đầu cá Mĩ sau khi xử lý sạch, được đem đi xay nhỏ, sau đĩ thủy phân bằng enzyme Protamex với tỷ lệ enzyme/nguyên liệu và nước/nguyên
Điều kiện thủy phân:
- Tỷ lệ nước/NL - Tỷ lệ E/NL - Nhiệt độ - Thời gian - pH thủy phân Ly tâm Lọc
Thủy phân bằng enzyme Protamex
Dịch lọc
Ức chế hoạt động của enzyme
Dịch đạm thủy phân Bảo quản Đầu cá Mĩ Xay nhỏ Xương Cặn ly tâm Dầu cá
liệu nhất định. Quá trình thủy phân diễn ra theo nhiệt độ và thời gian nhất định, pH tự nhiên củabản thân nguyên liệu, nhiệt độ được duy trì ở bể ổn nhiệt. Khi quá trình thủy phân kết thúc, ta ức chế hoạt động của enzyme ở 950C trong 15 phút [10].
- Hỗn hợp sau khi thủy phân xong sẽ được cho qua rây nhằm tách riêng phần xương cá và dịch lọc. Lúc này, dịch lọc sẽ được ly tâm với máy ly tâm lạnh ở 40C, tốc độ 6000 vịng/ phúttrong 30 phút. Kết thúc quá trình ly tâm, thu được kết quả như sau: lớp dầu cá trên cùng, dịch đạm thủy phân ở giữa và cặn ly tâm ở dưới đáy. Ta tách riêng dịch đạm thủy phân rồi đem đi bảo quản đơng ở nhiệt độ -200C.
2.2.3. Thí nghiệm xác định các thơng số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu cá Mĩ bằng enzyme Protamex
- Bố trí thí nghiệm theo phương pháp cổ điển.
- Các thơng số cố định: pH tự nhiên, tỷ lệ nước/nguyên liệu. - Các thơng số cần nghiên cứu:
+ Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/NL); + Nhiệt độ thủy phân;
+ Thời gian thuỷ phân;
- Các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng của quá trình thủy phân là: độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac.
2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu (E/NL): Mục đích thí nghiệm Mục đích thí nghiệm
Xác định tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu thích hợp để thủy phân đầu cá Mĩ thu được sản phẩm cĩ độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitơ cao.
Cách tiến hành
Đầu cá Mĩ đã xay nhỏ và đơng lạnh, được rã đơng cho vào 5 cốc thủy tinh 250 ml mỗi cốc 100g nguyên liệu. Tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thơng số như: lượng nước thêm vào 100ml (tỷ lệ nước/NL 1:1), nhiệt độ thủy phân 500C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân là 4h, tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu lần lượt : 0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%.
Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, ta ức chếhoạt động của enzyme ở nhiệt độ 950C trong 15 phút rồi cho sản phẩm thủy phân qua rây để tách phần xương và dịch lọc.
Phần dịch lọc đem ly tâm thu được ba phần: lipid, dịch thủy phân, cặn thủy phân. Dịch đạm thủy phân sẽ được đem đi xác định độ thủy phân,hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac. Từ đĩ, sẽ lựa chọn được tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu thích hợp nhất.
Sơ đồ:
Hình 2.4. Sơ đồ bố tríthí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp
Ức chế hoạt động của enzyme Lọc
Dịch lọc
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp
Xác định độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac Nguyên liệu đã nghiền nhỏ đơng lạnh (100g)
Rã đơng
Thủy phân (N/NL là 1:1, nhiệt độ 500C,pH tự nhiên, thời gian 4h), tỷ lệ E/NL như sau:
Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Mẫu 2 (0,3%) Mẫu 4 (0,7%) Mẫu 5 (0,9%)
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp: Mục đích thí nghiệm: Mục đích thí nghiệm:
Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thủy phân đầu cá Mĩ thu được sản phẩm thủy phân cĩ độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitơ cao.
Cách tiến hành:
- Đầu cá Mĩ đã xay nhỏ và đơng lạnh sau đĩ rã đơng cho vào 5 cốc thủy tinh 250 ml mỗi cốc 100g nguyên liệu.Tiến hành thủy phân 5 mẫu với các thơng số như: lượng nước thêm vào là 100ml (tỷ lệ nước/NL 1:1), tỷ lệ enzyme/NL thích hợp đã được xác định ở trên, pH tự nhiên, thời gian thủy phân là 4h, nhiệt độ thủy phân lần lượt là 450C, 500C, 550C, 600C, 650C.
- Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, ta ức chế hoạt động của enzyme ở nhiệt độ 950C trong 15 phút rồi cho sản phẩm thủy phân qua rây để tách phần xương và dịch lọc.
- Phần dịch lọc đem ly tâm thu được ba phần là: lipid, dịch thủy phân, cặn thủy phân. Dịch thủy phân sẽ được đem đi xác định độ thủy phân,hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac.Từ đĩ, sẽ lựa chọn được nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất.
Sơ đồ:
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp
Ức chế hoạt động của enzyme
Lọc
Dịch lọc
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Xác định độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac Nguyên liệu đã nghiền nhỏ đơng lạnh (100g)
Rã đơng
Thủy phân (N/NL là 1:1, tỷ lệ E/NLopt, pH tự nhiên, thời gian thủy phân là 4h), nhiệt độ thủy phân như sau:
Mẫu 1 (450C) Mẫu 3 (550C) Mẫu 4 (600C) Mẫu 2 (500C) Mẫu 5 (650C)
2.2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp: Mục đích thí nghiệm.
Xác định thời gian thủy phân thích hợp để thủy phân đầu cá Mĩ thu được sản phẩm thủy phân cĩ độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitơ cao.
Cách tiến hành.
- Đầu cá Mĩ đã xay nhỏ và đơng lạnh, sau đĩ tiến hành rã đơng cho
vào 6 cốc thủy tinh 250 ml mỗi cốc 100g nguyên liệu. Tiến hành thủy phân 6 mẫu với các thơng số như sau: tỷ lệ nước/nguyên liệu:1/1, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu thích hợp đã chọn ở trên, nhiệt độ thủy phân thích hợp đã chọn ở trên, pH tự nhiên, thời gian thủy phân lần lượt là: 1h,2h,3h,4h,5h,6h.
- Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, ta ức chếhoạt động của enzyme ở nhiệt độ 950C trong 15 phút rồi cho sản phẩm thủy phân qua rây để tách phầnxương và dịch lọc.
- Phần dịch lọc đem ly tâm thu được ba phần là: lipid, dịch thủy phân, cặn thủy phân. Dịch thủy phân sẽ được đem đi xác định độ thủy phân,hiệu suất thu hồi nitơ và hàm lượng nitơ amoniac. Từ đĩ, sẽ lựa chọn được thời gian thủy phân thích hợp nhất.
Sơ đồ:
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp.
Nguyên liệu đã nghiền nhỏ đơng lạnh (100g)
Rã đơng
Thủy phân (tỷ lệ N/NL là 1:1, tỷ lệ E/NLopt, t0opt , pH tự nhiên), thời gian thủy phân như sau:
Mẫu 1 (1h) Mẫu 3 (3h) Mẫu 4 (4h) Mẫu 2 (2h)) Mẫu 6 (6h) Mẫu 5 (5h)
Ức chế hoạt động của enzyme Lọc
Dịch lọc
Dịch đạm thủy phân Ly tâm
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
2.2.4. Phương pháp phân tích.
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700 –1990.
- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao 6000C theo TCVN 5611- 1991.
- Xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo
TCVN 4328-2001.
- Xác định hàm lượng Nitơ amoniac bằng phương pháp chưng kéo hơi
nước theo TCVN 3706-1990.
- Xác định hàm lượng nitơ formol theo phương pháp Sorensen.
- Xác định hàm lượng nitơ axít amin theo cơng thức: Naa = Nformol – NNH3
- Phương pháp xác định độ thủy phân theo phương pháp DNFB được
mơ tả bởi Nguyen và cộng sự (2011).
2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU.
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPSS 16.0. Kết quả được báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần phân tích ± độ lệch chuẩn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 THÀNH PHẦN HĨA HỌC ĐẦU CÁ MĨ
Thành phần hĩa học cơ bảncủa đầu cá Mĩ được thể hiện ởBảng 3.1.Kết quả cho thấy, đầu cá Mĩ chứa các thành phần cơ bản bao gồm nước, protein, lipit và tro lần lượt là: 69,73%; 14,93%; 6,05% và 9,17%. Từ kết quả trên ta thấy nguyên liệu đầu cá Mĩ cĩ hàm lượng protein khá cao.Vì thế, đầu cá Mĩ cĩ thể tận dụng để thu hồi protein bằng cách sản xuất dịch đạm thủy phân và ứng dụng trong lĩnh vực thức ăn chăn nuơi và thực phẩm.
Bảng 3.1. Thành phần hĩa học cơ bản của đầu cá Mĩ. Thành phần Hàm lượng (%)
Nước 69,73± 0,25
Protein 14,93 ± 0,04
Tro 9,17 ± 0,09
Lipid 6,05± 0,05
3.2.XÁC ĐỊNH THƠNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN ĐẦU CÁ MĨ BẰNG ENZYME PROTAMEX
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến quá trình thủy phân đầu cá Mĩ. đầu cá Mĩ.
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến quá trình thủy phân đầu cá Mĩ được thể hiện trên Hình 3.1, 3.2, 3.3:
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến độ thủy phân. Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p< 0,05).
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến hiệu suất thu hồi nitơ. Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p< 0,05).
0 5 10 15 20 25 30 35 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Đ ộ t h ủ y p h â n ( %) Tỉ lệ enzyme/nguyên liệu (%) a b c c c 0 10 20 30 40 50 60 70 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 H iệ u s u ấ t th u h ồ i N it ơ ( g N /l )
Tỉ lệ enzyme/ nguyên liệu (%)
a
b
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến hàm lượng NH3. Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p< 0,05).
Dựa vào Hình 3.1 ta thấy, khi tỷ lệ enzyme tăng từ 0,1% đến 0,5% độ thủy phân (DH) tăng một cách đáng kể từ 16,1% - 28,35%. Nhưng khi tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme lên 0,7% và 0,9% lúc này giá trị DH chỉ tăng nhẹ từ 29,15% - 29,50% và khơng cĩ sự khác nhau cĩ ý nghĩa về độ thủy phân ở các mẫu tỷ lệ enzyme 0,5%, 0,7%, 0,9%. Trong khi đĩ, ở Hình 3.2 cho thấy ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hiệu suất thu hồi nitơ, cũng cĩ xu hướng tương tự khi tăng tỷ lệ enzyme từ 0,1% đến 0,5% thì hiệu suất thu hồi Nitơ tăng từ 46,44% - 63,74%. Nhưng khi tăng tỷ lệ enzyme lên 0,7 và 0,9% lúc này hiệu suất thu hồi Nitơ vẫn tiếp tục tăng lần lượt là 66,06% - 67,01% nhưng khơng đáng kể và khơng cĩ sự khác nhau cĩ ý nghĩa ở các mẫu tỷ lệ enzyme từ 0,5% đến 0,9%. Kết quả này cũng cĩ xu hướng tương tự như kết quả nghiên cứu trên đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme protamex (Ts. Nguyễn Thị Mỹ Hương,2012). Ngồi hai thơng số cần khảo sát là độ thủy phân (DH) và hiệu
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 H à m l ư ợ n g N it ơ a m o n ia c (g N /l )
Tỉ lệ enzyme/ nguyên liệu (%)
a
ab
b
c
suất thu hồi Nitơ, hàm lượng amoniac cũng là thơng số cần chú ý. Kết quả Hình 3.3 ta thấy được sự ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng amoniac trong dịch thủy phân. Nhìn chung, khi tăng tỷ lệ enzyme từ 0,1% đến 0,5% hàm lượng nitơ amoniac tăng rất ít từ 0,59% đến 0,74%. Khi tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme lên 0,7% và 0,9% thì hàm lượng nitơ amoniac tăng khơng đáng kể, cũng như khơng cĩ sự khác nhau cĩ ý nghĩa về thơng số này. Kết quả nghiên cứu về hàm lượng amoniac cho thấy dịch đạm thủy phân thu được cĩ độ an tồn cho phép[16].
Điều này được giải thích như sau: Enzyme Protamex thuộc loại endoprotease, khi thủy phân chúng cắt mạch polypeptide để tạo thành các đoạn peptid ngắn hơn và các axít amin. Khi tăng tỷ lệ enzyme thì khả năng cắt mạch polypeptide sẽ tăng lên dẫn đến độ thủy phân (DH) tăng. Khi mức độ thủy phân (DH) tăng dẫn đến hiệu suất thu hồi Nitơ tăng [8,9]. Khi độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi Nitơ tăng sẽ thúc đẩy quá trình chuyển hĩa các sản phẩm thủy phân thu được thành NH3 bởi các vi sinh vật sẵn cĩ trong nguyên liệu đầu cá.
Từ kết quả phân tích như trên,tơi thấy rằng ở tỷ lệ enzyme 0,5% cho độ thủy phân và hiệu suất thu hồi Nitơ cao với hàm lượng nitơ amoniac ở mức cho phép. Vì thế, tơi chọn tỷ lệ enzyme 0,5% để tiếp tục nghiên cứu các thơng số cho quá trình thủy phân.
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình thủy phân đầu cáMĩ.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân được trình bày ở đồ thị Hình 3.4, 3.5 và 3.6.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến độ thủy phân (DH). Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p< 0,05)
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi Nitơ. Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, với các chữ cái khácnhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p< 0,05).
22 23 24 25 26 27 28 29 30 45 50 55 60 65 Đ ộ t h ủ y p h â n ( %)
Nhiệt độ thủy phân 0C