Hoạt tính bacteriocin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi khuẩn thử nghiệm và vi chỉ thị [4].
Thu dịch bacteriocin:
Các chủng cần kiểm tra tính kháng sau khi được bảo quản ở -800C cần được rã đơng rồi hút 1 ml dịch vi khuẩn hoạt hĩa trong các bình tam giác mơi trường TSB bằng cách lắc qua đêm ở 180 vịng phút. Sau đĩ, đo OD600 ban đầu (OD1), OD1 nằm trong khoảng 1 - 2 thì chuyển sang nuơi cấy lần 2. Mức OD600 ban đầu lần hai (OD2) được đưa về mức 0,06. Tiếp tục nuơi cho đến khi OD600 là 1.5 - 2.
Hút 10 ml dịch vi khuẩn vào ống falcol để ly tâm (6000 rpm, 30 phút, 40
C). Sau đĩ thu dịch nổi tế bào, loại bỏ tế bào và trung hịa pH tới 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N. Dịch nổi này được coi như là dịch bacteriocin thơ và kiểm tra khả năng đối kháng.
Xác định hoạt tính sinh bacteriocin:
- Đổ 15 ml mơi trường nuơi vào đĩa petri vơ trùng, để thạch đơng. - Cấy trang 100 µl vi khuẩn chỉ thị lên bề mặt đĩa thạch.
- Đục các giếng cĩ đường kính 7 mm trên đĩa thạch.
- Nhỏ 100 µl dịch nổi tế bào của vi khuẩn thử nghiệm vào trong giếng.
- Sau 24 giờ hoạt tính bacteriocin được xác định theo kích thước của vịng kháng khuẩn.
Hoạt tính bacteriocin thơ được xác định dựa vào đường kính vịng kháng với chủng chỉ thị và được xác định như sau [43]:
Trong đĩ :
dkk: Đường kính vịng kháng khuẩn (mm).
D : Tổng đường kính vịng phân giải và đường kính lỗ đục (mm). dlỗ: Đường kính lỗ đục (mm).
(dkk > 1mm: Được coi là cĩ hoạt tính kháng khuẩn)
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và enzyme đến hoạt tính của bacteriocin
2.2.4.1. Xác định độ bền với enzyme
Dịch bacteriocin thơ được thử độ bền với các enzyme catalase, proteinase K, α-amylase, lipase, trypsin và α-chymotrypsin.
Mục đích: Xử lý catalase nhằm xác định ảnh hưởng của H2O2 tới khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin [43] và loại bỏ sự tác động này. Xử lý proteinase K, α-amylase, lipase, trypsin và α-chymotrypsin nhằm xác định bản chất và đặc điểm cấu trúc của bacteriocin. Bacteriocin cĩ bản chất là protein nên sẽ bị thủy phân bởi các enzyme thủy phân protein. Tùy vào cấu trúc protein mà sẽ bị tác động bởi endopeptidase (proteinase K) hay exopeptidase (trypsin và α-chymotrypsin). Một số bacteriocin được tạo thành từ phức hợp, chúng cĩ thể gắn lipid hoặc cacbonhydrate, sử dụng enzyme α-amylase, lipase cĩ thể kiểm tra xem bacteriocin cĩ phải là phức hợp hay khơng.
Phương pháp thực hiện như sau:
Thu dịch bacteriocin thơ:
Nuơi cấy các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin, thu dịch nuơi cấy và ly lâm ở điều kiện 6000 vịng/phút, 30 phút, 40C. Thu dịch nổi, chuẩn độ pH của dịch về giá trị 7 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc bằng HCl 1N. Dịch này được coi là dịch bacteriocin thơ.
Xử lý enzyme:
Trước tiên xử lý dịch thơ bằng enzyme catalase sao cho tỉ lệ enzyme dịch thơ đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg ml, thời gian xử lý 30 phút, ở nhiệt độ phịng (300C). Dịch thơ sau khi được xử lý với enzyme cactalase thì tiếp tục được xử lý với các
enzyme proteinase K, α-amylase, lipase, trypsin và α-chymotrypsin. Các loại enzyme (đã được pha sẵn trước đĩ với nồng độ 20 mg ml) sẽ được bổ sung vào dịch bacteriocin sao cho tỷ lệ enzyme dịch bacteriocin thơ của vi khuẩn phải đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg 1ml.
Mẫu sau khi được bổ sung enzyme thì tiến hành ủ như sau: - Mẫu xử lý với enzyme α-amylase ủ ở 200C trong 2 giờ;
- Mẫu xử lý với enzyme proteinase K, lipase, trypsin và α-chymotrypsin ủ ở 370C trong 3 giờ.
Sau đĩ đem bất hoạt enzyme trong mẫu ở 40C trong vịng 10 phút [3]. Sau khi xử lý enzyme, hoạt tính cịn lại của dịch bacteriocin được kiểm tra dựa trên kích thước vịng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Mẫu đối chứng là dịch bacteriocin thơ khơng bổ sung enzyme, được xử lý cùng điều kiện với dịch bacteriocin bổ sung enzyme. Đọc kết quả vịng kháng khuẩn sau 12 - 24 giờ.
2.2.4.2. Xác định độ bền với nhiệt của dịch bacteriocin
Nuơi cấy vi khuẩn và tiến hành thu dịch bacteriocin thơ, chuẩn độ pH về giá trị 7. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5 ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 600C, 1000C trong 15 phút và 30 phút và 1210C trong 15 phút.
Mẫu đối chứng là dịch bacteriocin thơ khơng xử lý nhiệt, để ở nhiệt độ phịng (300C). Sau khi xử lý nhiệt, kiểm tra hoạt tính cịn lại của dịch bacteriocin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin
Các thao tác nuơi cấy và chuẩn bị dịch bacteriocin thơ tương tự như trên, hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng cĩ ghi sẵn các giá trị pH cần chuẩn, mỗi ống 10 ml dịch. Điều chỉnh dịch bacteriocin về các giá trị pH 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N, ủ ở 370C, 30 phút. Cuối cùng chuẩn pH về giá trị 7. Mẫu đối chứng là mơi trường TSB. Hoạt tính cịn lại của dịch bacteriocin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đọc kết quả sau 12 – 24 giờ.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin cĩ hoạt tính kháng khuẩn mạnh
Việc xác định tính đối kháng cũng như xác định đường kính vịng kháng của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin với một chủng vi khuẩn cĩ hại nào đĩ là rất cần thiết trong tuyển chọn chủng sinh bacteriocin mạnh. Tính đối kháng thể hiện qua việc dịch nuơi của vi khuẩn khuếch tán vào mơi trường và gây ức chế chủng chỉ thị dẫn đến xuất hiện vịng kháng khuẩn trên đĩa thạch.
Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn chủng vi khuẩn cĩ hoạt tính sinh bacteriocin mạnh từ 12 chủng đã tuyển chọn sơ bộ nhằm định hướng sản xuất thuốc phịng trừ dịch bệnh trong NTTS. Do đĩ, chúng tơi khảo sát tính kháng khuẩn của 12 chủng vi khuẩn biển đối với một số chủng chỉ thị gây bệnh trên người và động vật thủy sảnlà P. mirabilis T14, E. coli BL21 và E. coli DH10b.
Bảng 3.1. Vịng kháng khuẩn của các chủng nghiên cứu đối với 3 chủng chỉ thị Chủng sinh bacteriocin
Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm)
P. mirabilisT14 E. coli BL21 E. coli DH10b
CT1.1 7 0 0 CR9.1 22 4 0 CR10 15 11 4 CR15 18 5 0 G1 6 4 4 R2 21 4 0 M2 0 0 0 N14 4 0 0 T9 0 0 0 T14 - 0 0 B3.7.1 4 0 0 B3.10.2 8 0 0 Chú thích: – Khơng khảo sát
Kết quả Bảng 3.1 và Hình 3.1 cho thấy, với chủng chỉ thị P. mirabilis T14, thì hầu hết các chủng thử nghiệm đều cĩ hoạt tính, trừ chủng T9 và M2. Chủng cĩ hoạt tính mạnh nhất với chỉ thị T14 là CR9.1, CR10, CR15 và R2 (≥15mm), các chủng
cịn lại cũng cĩ hoạt tính kháng T14, tuy nhiên, hoạt tính yếu, tạo vịng kháng nhỏ hơn 10mm.
Hình 3.1. Vịng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn đối với chủng chỉ thị T14 (A), BL21 (B) và DH10b (C)
Cĩ rất ít chủng kháng được 2 chủng chỉ thị BL21 và DH10b và vịng kháng nhỏ, hầu như là nhỏ hơn 10mm. Với chỉ thị BL21 thì cĩ 4 chủng cĩ hoạt tính kháng là CR9.1, CR10, CR15 và R2, hoạt tính mạnh nhất trong 4 chủng này với chỉ thị BL21 là chủng CR10 với đường kính vịng kháng là 11mm. Hầu như bacteriocin của các chủng khơng cĩ hoạt tính kháng với chỉ thị DH10b, chỉ cĩ chủng CR10 và G1 là cĩ hoạt tính, tuy nhiên, vịng kháng nhỏ, chỉ 4mm. Dựa vào kết quả trên, các chủng là CR9.1, CR10, CR15 và R2 cĩ hoạt tính kháng mạnh với P. mirabilis T14. Do đĩ, chúng tơi lựa chọn 4 chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo.
G1
A B
3.2. Mối quan hệ giữa sinh trƣởng và sinh bacteriocin của một số vi khuẩn biển sinh bacteriocin
Kết quả thể hiện trong Bảng 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 và Hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4.
Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng CR9.1 Thời gian nuơi cấy
(giờ) Mật độ tế bào (OD600 ) Đƣờng kính vịng kháng khuẩn D-d (mm) 0 0.06 - 1 0.42 17 1.5 0.85 18 2 1.13 22 2.5 1.27 23.5 3 1.57 24 3.5 1.60 28 4 1.64 25 4.5 1.69 23 5 1.73 19 5.5 1.80 18 6 1.87 17.5 6.5 1.93 16.5 7 2.03 - 8 2.05 - 24 2.88 - Chú thích: - : Khơng khảo sát
Hình 3.2. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng CR9.1 nuơi trên mơi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0.2, nhiệt độ phịng và lắc 180 vịng/phút
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng CR10
Thời gian nuơi cấy (giờ) Mật độ tế bào (OD600 ) Đƣờng kính vịng kháng khuẩn D-d (mm) 0 0.06 - 1 0.37 - 2 0.56 - 3 0.56 11 3.5 0.70 11.5 4 0.80 12 4.5 0.85 12 5 1.04 13 5.5 1.20 13.5 6 1.24 23 6.5 1.38 30 7 1.43 26 7.5 1.50 23 8 1.67 22.5 8.5 1.73 22 9 1.90 - 24 2.89 - Chú thích: - : Khơng khảo sát
Hình 3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng CR10 nuơi trên mơi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0.2, nhiệt độ phịng và lắc 180 vịng/phút
Bảng 3.4. Khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng CR15
Thời gian nuơi cấy (giờ) Mật độ tế bào (OD600 ) Đƣờng kính vịng kháng khuẩn D-d (mm) 0 0.06 - 1 0.25 - 2 0.37 - 3 0.56 11 3.5 0.79 11 4 0.84 11.5 4.5 0.96 12 5 1.07 12.5 5.5 1.30 13 6 1.37 25 6.5 1.55 25.5 7 1.65 28 7.5 1.73 26 8 1.85 25 8.5 1.92 24.5 9 2.06 - 24 2.93 - Chú thích: - : Khơng khảo sát
Hình 3.4. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng CR15 nuơi trên mơi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0.2, nhiệt độ phịng và lắc 180 vịng/phút
Bảng 3.5. Khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng R2 Thời gian nuơi cấy
(giờ) Mật độ tế bào (OD600 ) Đƣờng kính vịng kháng khuẩn D-d (mm) 0 0.06 - 1 0.32 - 2 0.47 - 3 0.48 10 3.5 0.69 10.5 4 0.84 11 4.5 1.00 11.5 5 1.03 12.5 5.5 1.34 25 6 1.37 18 6.5 1.54 15.5 7 1.62 15 7.5 1.68 15 8 1.76 13 8.5 1.83 12 9 1.97 - 24 2.82 - Chú thích: - : Khơng khảo sát
Hình 3.5. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng R2 nuơi trên mơi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0.2, nhiệt độ phịng và lắc 180 vịng/phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả quan sát các chủng CR9.1, CR10, CR15 và R2 trong quá trình nuơi cấy cho thấy chúng sinh trưởng và phát triển chậm ở thời gian đầu khi bắt đầu nuơi cấy từ OD600= 0,06, nhưng sau đĩ thì dần dần OD600 tăng nhanh.
Giai đoạn cĩ giá trị OD600 tăng chậm đối với CR9.1 là từ khoảng 0 – 1 giờ và từ 0 – 3 giờ đối với chủng CR10, CR15 và R2. Sau 1 giờ nuơi cấy, giá trị OD600 của chủng CR9.1 tăng lên 0,42, chủng CR10 tăng 0,37, chủng CR15 tăng 0,25 và chủng R2 tăng 0,32. Thời gian cĩ giá trị OD600 tăng chậm của chủng CR10, CR15 và R2 kéo dài hơn so với chủng CR9.1. Lúc này do mới cấy chuyền sang mơi trường mới nên chủng vi khuẩn phải thích nghi và làm quen với mơi trường, sau đĩ chúng mới cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành phần mơi trường.
Giai đoạn mật độ tế bào tăng nhanh là giai đoạn từ 1 – 6 giờ đối với chủng CR9.1, sau 3 giờ đối với 3 chủng CR10, CR15 và R2. Mật độ tế bào tăng nhanh cĩ thể vì các enzyme phân giải mơi trường đã cĩ sẵn, dinh dưỡng mơi trường giàu và ổn định nên các thành phần mơi trường được tổng hợp với tốc độ đều và quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ. Số lượng tế bào tăng theo lũy thừa. CR9.1 tăng trưởng nhanh hơn so với các chủng cịn lại, sau 3 giờ đã đạt được giá trị OD600 là 1,57, tăng 0,3 so với lúc 2,5 giờ. Cịn chủng CR10 sau 7,5 giờ mới tăng đến giá trị 1,50, chủng CR15 sau 6,5 giờ đạt OD600 là 1,55, cùng thời điểm này giá trị OD600 của chủng R2 đạt 1,54. Thời gian cĩ mật độ tế bào (OD600) tăng nhanh của 3 chủng CR10, CR15 và R2 cũng dài hơn so với chủng CR9.1.
Đối với chủng CR9.1, sau 7 giờ nuơi cấy, giá trị OD600 vẫn tăng nhưng chậm. Cĩ thể do một số nguyên nhân như chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxy giảm, các chất độc tích lũy, pH thay đổi… dẫn đến khả năng trao đổi chất giảm. Sự tích tụ sinh khối, xác tế bào và cả những sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cĩ thể là nguyên nhân làm cho giá trị OD600 vẫn tăng.
Chủng CR9.1 đạt OD600 sau 24 giờ nuơi cấy là 2,88, chủng CR10 là 2,89, chủng CR15 là 2,93 và chủng R2 là 2,82. Đường kính vịng kháng của dịch bacteriocin trong giai đoạn này dần giảm đi. Giảm nhanh và nhiều nhất là ở chủng R2, sau 8,5 giờ nuơi cấy, đường kính vịng kháng chỉ cĩ 12mm. Trong khi đĩ, đường kính vịng kháng của các chủng cịn lại cũng giảm nhưng giảm chậm hơn. Đường kính vịng kháng của chủng CR10 và CR15 đến lúc này vẫn cao (>20mm).
Sự sản sinh của bacteriocin cùng với quá trình sinh trưởng của tế bào. Với chủng CR9.1, sau 1 giờ nuơi cấy, đường kính vịng kháng khuẩn khá lớn là 17mm. CR10, CR15 và R2 cĩ thời gian sinh trưởng dài hơn, nên sau 3 giờ nuơi cấy, đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng là 11mm, 11mm và 10mm. Giai đoạn đầu, vi khuẩn mới dần thích nghi với mơi trường, quá trình trao đổi chất cịn diễn ra chậm nên lượng bacteriocin sinh ra cũng chưa được nhiều. Theo thời gian nuơi cấy, lượng bacteriocin cũng tăng dần lên và đạt giá trị cực đại sau 3,5 giờ nuơi cấy đối với chủng CR9.1(OD600= 1,60), của chủng CR10 là sau 6,5 giờ (OD600 = 1,38), đối với chủng CR15 là sau 7 giờ nuơi (OD600 = 1,65) và chủng R2 là sau 5,5 giờ (OD600 = 1,34). Đường kính vịng kháng khuẩn của dịch bacteriocin sinh bởi 4 chủng CR9.1, CR10, CR15 và R2 ở thời điểm này tương ứng là 28mm, 30mm, 28mm và 25mm.
Do điều kiện thí nghiệm cịn hạn chế nên khơng thể theo dõi hết quá trình sinh trưởng và phát triển của 4 chủng CR9.1, CR10, CR15 và R2. Nhưng đã xác định thời điểm sinh bacteriocin cực đại thuộc giai đoạn cĩ mật độ tế bào tăng nhanh. Thời điểm sinh bacteriocin cực đại của các chủng sẽ được chọn để thu dịch bacteriocin thơ trong các thử nghiệm tiếp theo.
3.3. Ảnh hƣởng của enzyme, nhiệt độ và pH đến tính kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn biển
3.3.1. Ảnh hƣởng của enzyme đến hoạt tính kháng khuẩn
Việc xác định bản chất kháng khuẩn được lặp lại 3 lần với enzyme proteinase K, α-amylase, lipase, trypsin và α-chymotrypsin.
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy đường kính vịng kháng khuẩn của 4 chủng đã giảm đi sau khi xử lý enzyme catalase, chứng tỏ enzyme catalase cĩ tác động đến khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của 4 chủng, nĩ đã loại đi ảnh hưởng của H2O2 đến khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin. Đường kính vịng kháng khuẩn của chủng CR9.1 và CR15 giảm nhưng khơng đáng kể sau khi xử lý catalase (Bảng 3.6), trong khi đường kính vịng kháng khuẩn của CR10 và R2 giảm khá nhiều (Hình 3.6B, 3.6D), nhiều nhất là ở chủng R2, đường kính vịng kháng đã giảm đi gần 10mm.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các enzyme đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thơ từ chủng CR9.1, CR10, CR15 và R2, chủng chỉ thị P. mirabilis T14
Xử lý enzyme Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) CR9.1 CR10 CR15 R2 Đối chứng 9 15 12 22 Catalase 8 9,5 11 13 Proteinase K 0 0 0 0 Trypsin 9 15 10,5 20 α- chymotrypsin 9 6 6 22 α- amylase 5 6.5 9 21 Lipase 8 8 9,5 22
Sau khi xử lý với enzyme proteinase K, dịch chiết ngoại bào của 4 chủng vi khuẩn bị mất hồn tồn hoạt tính kháng khuẩn đến chủng chỉ thị P. mirabilis T14. Trong khi đĩ mẫu đối chứng và mẫu xử lý enzyme trypsin, α- chymotrypsin vẫn