Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc

kích thích bởi zymosan

Wedelolactone có khả năng làm giảm sốt, chống ung thƣ. Tuy nhiên, vai trò của nó trong quá trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chƣa đƣợc chứng minh. Để đánh giá hiệu quả Wedelolactone trong quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone trong 45 phút. Sau đó, BMDM đƣợc ủ tiếp với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Wedelolactone đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm TNF, IL-6, IL12p40. Trái lại, đối với protein kháng viêm IL-10 thì Wedelolactone lại không có khả năng ức chế. Từ kết quả này cho thấy với nồng độ 20µg/ml thì wedelolactone cho hiệu quả tốt nhất.

Nồng độ cytokine (pg/ml) Nồng độ cytokine (pg/ml)

Hình 10: Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bằng zymosan 0 4000 8000 12000 DM 2.5 5 10 20 µg/ml TNF-α W zymosan 0 5000 10000 15000 IL-6 W zymosan DM 2.5 5 10 20 µg/ml 0 4000 8000 12000 DM 2.5 5 10 20 µg/ml IL-12p40 W 0 4000 8000 12000 IL-10 W zymosan DM 2.5 5 10 20 µg/ml zymosan

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 31 Khoá 2009-2011

BMDMs từ chuột được ủ cùng với W (20 µg/ml), hoặc đối chứng DMSO (0.1% DMSO) trong 45 phút trước khi ủ với zymosan 100 (µg/ml). Dịch sau sau khi tế bào được ủ với zymosan 18 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA. Dịch thu được sau 18 giờ sẽ đánh giá bằng phân tích ELISA . Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập. DM, media control; W, Wedelolactone; Dex.

4. Wedelolactone điều hòa quá trình sinh cytokine tiền viêm thông qua thụ thể Dectin-1

Thụ thể Dectin-1 tham gia chính trong quá trình nhận dạng miễn dịch ban đầu của nấm thông qua liên kết glucan [59]. Do đó, Wedelolactone đã đƣợc điều tra xem có khả năng ức chế quá trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích. Đối với mục đích này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với một số nồng độ tăng dần của laminarin, một chất có khả năng ức chế quá trình hoạt động của thụ thể Dectin-1 [27], hoặc polysaccharide galactan ở các nồng độ giống nhƣ laminarin sau 45 phút. Tiếp theo, các tế bào đƣợc ủ cùng với Wedelolactone (hình 11A), Dex (hình 11B) trƣớc khi ủ với zymosan. Tế bào ủ cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra cytokine ngƣợc lại với tế bào không sử lý với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine TNF-α, và IL-6 trong BMDMs đã tăng dần theo nồng độ của Laminarin. Trái lại, các tế bào đƣợc sử lý cùng với polysaccharide galactan vẫn cho kết quả giống nhƣ tế bào đƣợc sử lý với Wedelolactone. Giống nhƣ kết quả hình 11A, các kết quả trên hình 11B cũng cho kết quả tƣơng tự. Những kết quả này gợi ý rằng thụ thể Dectin-1 có một vai trò cơ bản trong quá trình Wedelolactone và Dex truyền đi quá trình ức chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 32 Khoá 2009-2011

Hình 11: Wedolactone hoặc Dex điều hòa quá trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thông qua thụ thể dectin-1.

BMDMs đã được ủ ban đầu cùng với chất đối vận thụ thể Dectin-1 ở các nồng độ laminarin (0,1, 0,25, 0,5 mg/ml), polysaccharide galactan (0,1, 0,25, 0,5 mg/ml) hoặc với dung môi đối chứng (0.1% DMSO) trong 60 phút trước khi sử lý Wedelolactone (20 µg/ml) (ở hình A) hoặc Dex (100 nM) (ở hình B) trong 45 phút. Dịch tế bào lấy được sau khi ủ với zymosan sẽ được đánh giá cytokine bằng phương pháp ELISA. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập. Dung dịch môi trường, M; Dung môi đối chứng, ĐC; Wedelolactone, W; Dexamethasone, Dex; Zymosan, Zym; Laminarin, Lam; Galactan, Gal.

5. Wedelolactone điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1

Zymosan có thể kích thích quá trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16]. Tuy nhiên, vai trò của Wedelolactone trong quá trình sinh ROS do zymonsan kích thích trong BMDB vẫn chƣa rõ. Để điều tra quá trình này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút trƣớc khi ủ với Wedelolactone (20g/ml) hoặc Dex (100nM). Sau đó, các tế bào này đƣợc ủ tiếp với zymosan trong 30 phút. Các tế bào này tiếp tục đƣợc ủ với DHE theo nhƣ phần phƣơng pháp. Nhƣ chỉ ra ở

Zym Khả năng sinh cytokine (ng/ml) W lam gal TNF- IL-12p40 0 4800 1200 2400 3600 TNF- 0 8000 2000 4000 6000 IL-6 0 800 200 400 600 IL-12p40 lam gal M ĐC ĐC W Dexa A B 0 4800 1200 2400 3600 0 8000 2000 4000 6000 IL-6 0 800 200 400 600 M ĐC ĐC **

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 33 Khoá 2009-2011

hình 12A, zymosan đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên quá trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế bào đƣợc ủ với Wedelolactone nhƣng quá trình này bị đảo ngƣợc đối với tế bào đƣợc ủ với Laminarin. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với tế bào đƣợc ủ với galactan. Trên hình 12B, kết quả tƣơng tự hình 12A khi thay Wedelolactone bằng Dex. Những kết quả này chỉ ra rằng Wedelolactone đã điều hòa quá trình sinh ROS do Zymosan kích thích trong BMDM thông qua thụ thể Dectin-1

Hình 12: Wedelolactone hoặc Dex ức chế quá trình sản sinh ROS đƣợc kích thích bởi zymosan thông qua Dectin-1

BMDMs được ủ với Laminarin (0,25 mg/ml), galactan (0.,5 mg/ml), hoặc dung môi (0,1% DMSO) trong 60 phút trước khi ủ với Wedelolactone (20 µg/ml; đối với A) hoặc Dex (100 nM; đối với B) trong 45 phút. Sau đó tế bào được ủ với zymosan (100 µg/ml) trong 30 phút. Sau đó các tế bào được ủ với DHE (chất huỳnh quang). Kết quả chỉ mật độ huỳnh quang của tế bào được xác định bằng kính hiển vi hội tụ lazer. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập. Wedelolactone, W; Zymosan, Zym; Dexamethasone, Dex; Laminarin, Lam; Galactan, Gal.

A B Quá trình sản xuất ROS(O2-) Zym W lam+ W gal+ W Quá trình sản xuất ROS(O2) Zym Dexa lam+ Dexa gal+ Dexa ***

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 34 Khoá 2009-2011

6. Wedelolactone bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra bởi zymosan

Zymosan kích thích quá trình viêm cấp tính và làm hỏng đa cơ quan trong các mô hình động vật bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [23,24]. Để đánh giá hiệu quả điều trị của Wedelolactone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, chuột đã đƣợc chia thành 4 nhóm khác nhau (mỗi nhóm 10 con) đƣợc tiêm với Wedelolactone lần lƣợt là 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg trọng lƣợng cơ thể và nhóm đối chứng không đƣợc tiêm Wedelolactone. Sau 24 giờ, các nhóm chuột này sẽ đƣợc tiêm Zymosan (2 mg/g trọng lƣợng cơ thể). Khả năng chuột sống xót đƣợc tính sau 5 ngày đƣợc tiêm với Zymosan. Trên hình 6 cho thấy chuột sau 5 ngày nếu không nhận đƣợc Wedelolactone đã chết 100%. Tuy nhiên, chuột nhận đƣợc Wedelolactone ở các nồng độ khác nhau thì khả năng sống xót đã tăng dần. Ở nồng độ Wedelolactone 20 mg/ml tỉ lệ sống xót gần 40% cũng gần giống nhƣ tỉ lệ chuột sống xót với Wedelolactone 30 mg/ml. Từ kết quả này, cho thấy Wedelolactone có thể cải thiện đƣợc quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm khuẩn tại nồng độ 20 mg/ml.

Chuột được chia làm 4 nhóm khác nhau (n = 10 con/ một nhóm). Nhóm thứ nhất không được tiêm Wedelolactone. Nhóm thứ 2 được tiêm Wedelolactone 10 mg/kg trọng lượng cơ thể. Nhóm thứ 2 nhận được 20 mg/kg trọng lượng cơ thể. Nhóm 3 nhận được 30 mg/kg trọng lượng cơ thể. Sau 24 giờ, các nhóm chuột này được tiêm với Zymosan (2 mg/g trọng lượng cơ thể). Khả năng sống đã được xác định sau 5 giờ đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày.

W= 10 mg/kg (n= 10) ĐC (n=10) 20 40 60 80 Khả năng sống xót (%) W= 20 mg/ kg (n=10) ĐC (n=10) 20 40 60 80 Khả năng sống xót (%) 20 40 60 80 100 Khả năng sống xót(%) W= 30 mg/ kg (n=10) ĐC (n=10) P=0.0123* 0 100 (h) 0 20 40 60 80 100 0 100 (h) 0 20 40 60 80 100 0 100 (h) 0 20 40 60 80

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh Lớp Cao học K18 35 Khoá 2009-2011 Nồng độ cytokine (pg/ml) Zym 3000 1000 2000 0 4000 TNF- ĐC ĐC W Zym 1500 500 1000 0 2000 Nồng độ cytokine (pg/ml) IL-6 ĐC ĐC W

7. Wedelolactone đã làm giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Để đánh giá khả năng điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thƣờng có hai chỉ tiêu quan trọng đƣợc đánh giá đó là đo huyết áp và nồng độ cytokine. Do vậy, huyết thanh của chuột sau bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng khi đƣợc tiêm Wedelolactone 20mg/ml và chuột không nhận đƣợc Wedelolactone đã đánh giá nồng độ TNF-α và IL-6. Kết quả chỉ ra ở hình 14 cho thấy nồng độ đã giảm đi đáng kể ở chuột nhận đƣợc Wedelolactone so với chuột không nhận đƣợc Wedelolactone. Những kết quả này chỉ ra rằng Wedelolactone có khả năng làm giảm lƣợng cytokine trong huyết thanh của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Hình 14: Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Máu của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng được nhận Wedelactone và chuột không được nhận Wedelolactone được tách huyết thành bằng ly tâm (10.000 vòng/phút). Sau đó các mẫu huyết thanh được xác định cytokine bằng đo ELISA. Chuột không nhận được Wedelolactone, ĐC; Chuột nhận được Wedelolactone, W; Zymosan, Zym.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 36 Khoá 2009-2011

8. Hiệu quả của Wedelolactone và Dexamethasone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Với một số kết quả đạt đƣợc ở trên, hiệu quả điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng đã đƣợc so sánh với Dexamethasone, một loại thuốc thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị. Chuột đƣợc nhận Wedelolactone hoặc Dexamethasone trƣớc 24 giờ. Sau đó, chuột đƣợc tiêm với zymosan. Số lƣợng chuột sống xót đƣợc xác định sau 5 ngày. Và lƣợng cytokine trong huyết thanh của chuột nhận đƣợc Wedelolactone hoặc Dexamethasone đã đƣợc đo huyết thanh. Hình 15A cho thấy tỉ lệ chuột nhận đƣợc Wedelolactone có tỉ lệ sống xót là 40%. Tuy nhiên, chuột nhận đƣợc Dexamethasone chỉ là gần 35%. Ngoài ra, trên hình 15B, cũng chỉ ra lƣợng cytokine tiền viêm ở chuột nhận Wedelolactone cũng giảm mạnh hơn so với chuột nhận đƣợc Dexamethasone. Từ những kết quả này gợi ý ra rằng Wedelolactone có hiệu quả cao trong quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Hình 15: Hiệu quả điều trị của Wedelolactone cao hơn so với Dexamethasone.

A B Zym Nồng độ Cytokine (pg/ml) Zym Nồng độ cytokine (pg/ml) ĐCĐC Dex W 1500 500 1000 0 2000 IL-6 0 20 40 60 80 100 (h) 0 20 40 60 80 100 Khả năng sống xót (%) W(20mg/kg) Dex (1mg/kg) ĐC 3000 1000 2000 0 4000 TNF- ĐC ĐC Dex W

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 37 Khoá 2009-2011

A, Chuột đƣợc chia làm 3 nhóm khác nhau (n = 10 con/ một nhóm). Nhóm thứ nhất không đƣợc tiêm Wedelolactone hoặc Dexamethasone. Nhóm thứ 2 đƣợc tiêm Wedelolactone 20 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. Nhóm 3 nhận đƣợc Dexamthasone 1mg/kg trọng lƣợng cơ thể. Sau 24 giờ, các nhóm chuột này đƣợc tiêm với zymosan (2 mg/g trọng lƣợng cơ thể). Khả năng sống đã đƣợc xác định sau 5 giờ đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày. B, Máu của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng đƣợc nhận Wedelactone và chuột không đƣợc nhận Wedelolactone đƣợc tách huyết thành bằng ly tâm (10.000 vòng/phút). Sau đó các mẫu huyết thanh đƣợc xác định cytokine bằng đo ELISA. Chuột không nhận đƣợc Wedelolactone, ĐC; Chuột nhận đƣợc Wedelolactone, W; Zymosan, Zym; Dexamethasone, Dex.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 38 Khoá 2009-2011

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KÊT LUẬN

1. Nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc vai trò của Wedelolactone với nồng độ 20μg/ml trong quá trình kháng viêm thông qua thụ thể Dectin-1 đã ức chế đƣợc quá trình sinh cytokine tiền viêm TNF, IL-6, IL12p40 của BMDM ở chuột.

2. Chứng minh đƣợc vai trò của Wedelolactone với nồng độ 20μg/ đã ức chế đƣợc quá trình sinh gốc oxy hóa thông qua thụ thể Dectin-1 của BMDM ở chuột.

3. Quan trọng hơn, Wedelolactone với nồng độ là 20mg/kg trọng lƣợng cơ thể có thể cải thiện đƣợc sự sống của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong cơ chế chống viêm bằng thử trên các đối tƣợng khác nhau ngoài chuột.

2. Xác định thêm Wedelolactone có phải là một cấu tử của thụ thể Glucocorticoid hay không.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 39 Khoá 2009-2011

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nguyễn Minh Thanh, Châu Văn Minh, Nguyễn Trọng Thông (2008) Nghiên cứu khả năng kháng viêm từ rong tảo biển Việt Nam. Tạp chí Hoá học. 46(5A): 81-90.

2. Đỗ Tất Lợi (2000) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học Hà Nội. 3. Đỗ Thị Oanh , Phạm Thanh Kỳ , Nguyễn Thi ̣ Bích Hằng , Nguyễn Tro ̣ng Thông ,

Phạm Thị Vân Anh (2010) Nghiên cƣ́u tác du ̣ng chống viêm và bảo vê ̣ gan của cao sói rừng (Sapium sebiferum) trên thƣ̣c nghiê ̣m . Tạp chí Dược học . 50(411): 36-39.

4. Hà Vân Oanh , Phạm Xuân Sinh , Nguyễn Thái An , Nguyễn Tro ̣ng Thông , Phạm Thị Vân Anh (2010) Nghiên cƣ́u tác du ̣ng chống viêm cấp của cao lỏng rễ bạch đồng nữ (Clerodendrum Chinese var. simplex (Mold) SL Chen) trên thƣ̣c nghiê ̣m. Tạp chí Dược học. 50(414): 20-23.

5. Nguyễn Thi ̣ Bích Hằng , Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Tro ̣ng Thông , Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Hoa Hiên (2009) Nghiên cƣ́u tác du ̣ng chống viêm của cao lỏng lá vọng cách (Premna corymbosa Rotteneen) thƣ̣c nghiê ̣m . Tạp chí Dược học. 48(389): 22-24.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

6. Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I.S., et al. (2006) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Protection of Staphylococcus aureus infected septic mice by suppression of Early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan. FEMS Immunology and Medical Microbiology 46: 187-197.

7. Annane, D., Sebille, V., Bellissant, E., the Ger-Inf Study Group. (2006)

Effects of low dose corticosteroids in septic shock patients with or without early acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med 34: 22-30.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 40 Khoá 2009-2011

8. Ariizumi, K., Shen, G.L., Shikano, S., Xu, S., Ritter, R., Kumamoto, T.,

Edelbaum, D., Morita, A., Bergstresser, P.R., Takashima, A. (2000) Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, dectin-1, by subtractive cDNA cloning. Journal of Biological Chemistry 275: 20157- 20167.

9.

10.

Attele, A.S., Wu, J.A., Yuan, C.S. (1999) Ginseng pharmacology:

Multiple constituents and multiple actions. Biochemical Pharmacology 58: 1685-1693.

Babior, B.M. (1999) NADPH oxidase: an update. Blood 93:146476. 11.

12.

Bailey, J.M. (1991) New mechanisms for effects of anti-inflammatory glucocorticoids. Biofactors 3: 97-102.

Barnes, P.J., Karin, M. (1997) Nuclear factor-kappaB: A pivotal transcription factor in chronic inflammatory disease. The England new journal of medicine 336: 1066-1071.

13. Bauer, S., Kirschning, C.J., Häcker, H., Redecke, V., Hausmann, S., Akira, S., Wagner, H., Lipford, G.B. (2001) Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci

98: 9237–9242. 14.

15.

16.

Bedard, K., Krause, K-H. (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev 87: 245–313.

Blanqué R, Meakin C, Millet S, Gardner CR (1998) Selective enhancement of LPS-induced serum TNF-alpha production by carrageenan pretreatment in mice. General Pharmacology. 31(2):301-6

Brown GD (2006) Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor. Nature. 6: 33-43.

17.

18.

Briegel, J., Kellermann, W., Forst, H., Haller, M., Bittl, M., Hoffmann, G.E., et al. (1994) Low-dose hydrocortisone infusion attenuates the systemic inflammatory response syndrome. The phospholipase A2 study group.

Clin Invest 72:/782-7.

Boguski MS (2002) News and views comparative genomics: The mouse that roared. Nature. 420: 515-516.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 41 Khoá 2009-2011

19. Brown, G.D., Gordon, S. (2001) Immune recognition. A new receptor for beta- glucans. Nature 413: 36-37. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

20. Brown, G.D. (2006) Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor. Natrure 6: 33-43.

21. Choi, K.T. (2008) Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C A Meyer. Acta

Pharmacol Sin. 29: 1109–1118.

22. Clark, A.R. (2007) Anti-inflammatory functions of glucocorticoid-induced