5. Nghiên cứu tối ưu và kiểm định quy trình phân tích
5.6. Đánh giá quy trình phân tích trên một mẫu thật
Mẫu nước nuơi trồng thủy hải sản được lấy từ tại nuơi tơm xã Hiệp Phước, huyện Nhà Bè. Bên cạnh đĩ một số mẫu khác như nước máy, nước ngầm và nước suối đĩng chai cũng được phân tích. Mẫu thật được phân tích bằng hệ thống FIA tự chế, cĩ sử
Chương
3
Kết quả và thảo luận
1. Tế bào đo dịng chảy và bộ phối trộn:
1.1. Tế bào đo dịng chảy:
Vật liệu chế tạo: vật liệu PVC khơng thể dùng chế tạo vì các lý do: khi khoan lỗ, PVC bị chảy do nhiệt từ mũi khoan, bề mặt khoan rất nhám và mũi khoan rất dễ gãy. Xét về mặt hĩa học, PVC là vật liệu khơng trơ như teflon và mica, dễ dàng bị hịa tan trong các dung mơi hữu cơ, trong khi teflon và mica thì khơng. Đặc tính tính của nhựa teflon là rất mềm và dai, do vậy khi khoan lỗ, bề mặt trong của lỗ rất nhám, mũi khoan cũng khơng thể khoan với kích thước dài hơn 2,0cm.
Vật liệu mica cĩ tính chất giịn, nhiệt nĩng chảy cao hơn PVC bề mặt khi khoan lỗ
nhẵn, cĩ thể khoan với kích thước dài hơn 2 cm. Do vậy trong thực nghiệm chúng tơi
đã chọn vật liệu mica để thử nghiệm.
Chiều dài: Về mặt kỹ thuật, khi chiều dài của tế bào dịng chảy càng tăng lên thì càng khĩ chế tạo, chiều dài tối đa chúng tơi cĩ thể làm được là 3,5cm. Đường kính trong của tế bào được khoan với kích thước 1,0cm giống như kích thước của tế bào dịng chảy ngoại nhập.
Về mặt lý thuyết, theo định luật Lamber – Beer, độ hấp thu sẽ tỉ lệ với chiều dài của tế bào đo. Điều này cĩ nghĩa là độ nhạy sẽ tăng khi chiều dài của tế bào đo càng tăng.
càng tăng. Do vậy, so sánh các loại tế bào dịng chảy chế tạo được, loại 3,5cm cho độ
nhạy tốt nhất. Hình 14 cịn cho thấy hệ thống FIA lắp ráp cĩ tính ổn định và độ lặp lại khá tốt giữa các lần tiêm mẫu.
Hình 14: Tín hiệu của dầu dị nitrit với tế bào dịng chảy cĩ các kích thước khác nhau. (Nitrit 2000ppb, thời gian hút mẫu 20s).
Như phần tổng quan đã trình bày, trong FIA độ bành rộng của pic đĩng vai trị khơng quan trọng trong phân tích bằng FIA, miễn là nĩ được giữa khơng đổi giữa các lần tiêm mẫu. Tuy nhiên, một hệ FIA được xem là khơng tốt nếu độ bành rộng của pic càng lớn. Về mặt lý thuyết, khi chiều dài tế bào càng ngắn, độ bành rộng của pic càng bé. Tuy nhiên kết quả trên khơng phản ánh được điều này, tức là độ bành rộng của pic khơng tăng theo chiều tăng của chiều dài của tế bào (hình 15).
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1,0cm 2,0cm 3,5cm
Chiều dài tế bào
C h i ề u c a o p ic ( A b s ) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 đ ộ b à n h r ộ n g ( m in s )
độ bành rộng chiều cao pic
Hình 15: So sánh độ tăng của chiều cao pic và độ bành rộng pic khi tăng chiều dài tế bào dịng chảy.
Điều này cĩ nguyên nhân từ sự phân tán giới hạn (D = 1 – 3), mà sự phân tán giới hạn này lại cĩ nguyên nhân từ sự tiêm một lượng mẫu khá lớn. Hình 16 cho thấy kết quảđo lường độ phân tán trong hệ thống.
Hình 16: Sự phân tán trong hệ thống FIA nghiên cứu (chiều dài bộ phối trộn: 250cm, thời gian hút mẫu 30s, tốc độ 1,90ml/phút.).
Độ phân tán tính được cĩ giá trị bằng 1,3 (ở thời gian tiêm mẫu 30s tương đương 850 µl mẫu được tiêm vào). Ở mức độ phân tán giới hạn này dẫn tới một hệ quả cĩ lợi: giữa trạng thái ổn định và trạng thái phân tán cĩ sự sai biệt khơng đáng kể, do đĩ ta cĩ thể phân tích mẫu ở trạng thái phân tán cĩ kiểm sốt mà vẫn độ nhạy vẫn đạt. Điều đĩ sẽ giúp giảm thời gian phân tích. Do đĩ về cơ bản, hệ thống FIA tự lắp ráp cĩ độ phân tán đạt yêu cầu cho phân tích. Độ phân tán là một giá trị đặc trưng cho một hệ thống FIA, phần 1.3. sẽ bàn luận sâu hơn về giá trị này.
Câu hỏi đặt ra là liệu chiều dài của tế bào dịng chảy càng dài thì càng tốt? Thực ra khơng phải. Vì trong nguyên lý phát hiện của detector FIA, sự phát hiện khơng phải ngay trực tiếp chất phân tích mà là sản phẩm phản ứng giữa chất phân tích và thuốc thử. Phản ứng hĩa học cần cĩ thời gian diễn tiến. Trong tế bào dịng chảy, từ lúc sản phẩm của chất phân tích bắt đầu đi vào tế bào tới lúc nĩ ra khỏi tế bào phải mất vài giây hoặc cĩ thể hơn 1 phút như kết quả ở trên. Trong thời gian đĩ phản ứng hĩa học tiếp tục diễn ra, điều này cĩ thể khiến cho hình dạng của pic bị biến dạng dẫn tới quá trình tính tích phân sẽ khơng cịn chính xác. Do vậy, chiều dài của tế bào dịng chảy
cần được tối ưu cho từng hệ thống và phương pháp phân tích. Với những kết quả thu
được ở trên và những kết quả nghiên cứu quy trình phân tích như cĩ thể thấy trong các phần nghiên cứu dưới đây chúng tơi cho rằng tế bào dịng chảy với chiều dài 3,5cm,
đường kính trong là 1,0mm là đạt yêu cầu cho phân tích nitrit.
1.2. Bộ phối trộn:
Bộ phối trộn là nơi diễn ra phản ứng hĩa học giữa thuốc thử và chất phân tích. Cấu tạo của bộ phối trộn này cũng ảnh hưởng tới độ phân tán cũng như độ nhạy, trong đĩ phải kể đến hình dạng, chiều dài, đường kính trong của bộ phối trộn. Để đạt được độ
nhạy tốt nhất, trong khi tiết kiệm được thời gian phân tích và thuốc thử cần thiết phải nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố trên.
Chiều dài của bộ phối trộn: Khi phản ứng hĩa học diễn ra trong hệ thống FIA diễn ra chậm, nĩ cần thời gian để diễn tiến. Bộ phối trộn giúp cho quá trình hịa trộn giữa thuốc thử và chất phân tích, làm cho phản ứng diễn ra thuận lợi. Chiều dài của nĩ ảnh hưởng đáng kể tới độ phân tán [1-3], nghĩa là chiều dài càng tăng, độ phân tán càng lớn, cường độ pic càng bé, độ nhạy càng giảm. Tuy nhiên chiều dài của bộ phối trộn lại cĩ tác dụng tăng thời gian phản ứng giữa thuốc thử và chất phân tích. Chiều dài càng tăng, thời gian phản ứng càng tăng, độ nhạy càng tăng. Phản ứng giữa nitrit và các thuốc thử acis sulfanilic và naptyletylendiamin cĩ tốc độ khá chậm, nhất là trong mơi trường cĩ nhiều clorua (mơi trường nước mặn, nước lợ) [18-19]. Do vậy chiều dài của bộ phối trộn cần được nghiên cứu. Ảnh hưởng của nĩ đến tín hiệu phân tích như cĩ thể
0.00 0.08 0.16 0.24 0.32 0.40 0 50 100 150 200 250 L (cm) A b s
Hình 17: Ảnh hưởng của chiều dài bộ phối trộn đến chiều cao của pic (Nitrit 1000ppb, thời gian tiêm mẫu 60s, tốc độ 1,90ml/phút).
Với chiều dài bộ phối trộn đạt từ 250cm trở lên, chiều cao của pic đã gần đạt mức cao nhất và dần đi tới bão hịa. Do vậy, chiều dài 250cm cĩ thể dùng để ứng dụng để
tiết kiệm thời gian phân tích. Với chiều dài này, tổng thời gian phân tích cho một mẫu (khơng kể thời gian tiêm mẫu) là 3,5 phút.
Đường kính trong của bộ phối trộn: Đường kính trong của bộ phối trộn ảnh hưởng khá mạnh đến hình dạng cũng như cường độ pic. Bộ phối trộn với đường kính trong càng lớn cường độ pic càng nhỏ, độ bành rộng càng tăng (hình 18). Tuy nhiên sự
tăng độ bành rộng này khơng tuyến tính theo sự tăng đường kính trong của ống, khi
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 1mm 2mm 3mm Đường kính trong (mm) C h i ề u c a o p ic 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Đ ộ b à n h r ộ n g ( p h ú t)
Chiều cao pic Độ bành rộng
Hình 18: Ảnh hưởng của đường kính trong của bộ phối trộn đến chiều cao và độ
bành rộng pic (Nitrit 1000ppb, thời gian hút mẫu 60s x 1,90ml/phút, chiều dài bộ phối trộn 100cm).
Điều này cũng dễ giải thích bởi vì đường kính trong của bộ phối trộn càng lớn, mức
độ pha lỗng (độ phân tán) của sản phẩm phản ứng càng mạnh, cũng như tốc độ chảy của dung dịch trong hệ thống cũng sẽ giảm. là nguyên nhân của sự suy giảm cường độ
pic cũng như sự bành rộng của pic.
Trong thực tế, ống teflon 1,0mm là loại hay được sử dụng ở trong nước cho các hệ
thống HPLC là loại dễ dàng tìm kiếm ở thị trường trong nước, do vậy chúng tơi sử
dụng loại ống teflon cĩ đường kính trong 1,0mm để chế tạo bộ phối trộn.
Hình dạng của bộ phối trộn: Trong hấu hết các ứng dụng, cấu tạo hình học của bộ
phối trộn chỉ cần giữa cho sự phối trộn được lặp lại giữa các lần phân tích, do vậy người ta ít quan tâm đến việc làm cầu ký hĩa cấu tạo của nĩ [3]. Tuy nhiên sự phối trộn trong lịng ống cũng cần diễn ra thuận lợi cho phản ứng giữa thuốc thử và chất phân tích. Sự chuyển vận của chất lỏng trong lịng ống diễn ra theo hai kiểu: kiểu dọc theo trục và chuyển động cầu. Mỗi cách chuyển vận đĩ sẽ làm cho mức độ phân tán cũng như phản ứng hĩa học trong lịng ống diễn ra với những mức độ khác nhau và dẫn tới hình dạng của pic thu được cũng khác nhau. Với loại bộ phối trộn hình thẳng, chuyển
Chuyển động dọc theo trục khiến cho các tác chất tiếp xúc và phản ứng với nhau chủ yếu qua khuếch tán, trong khi đĩ chuyển động cầu làm cho các tác chất trộn lẫn với nhau (theo chuyển động ngẫu nhiên) nhiều hơn sẽ làm phản ứng diễn ra hồn tồn hơn. Do vậy cĩ thể tiên đốn trước hai loại bộ phối trộn thắt nút và cuốn sẽ cĩ độ nhạy tốt hơn loại thẳng (hình 19). 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 Thắt nút Cuốn (coil) Thẳng A b s
Hình 19: So sánh chiều cao của pic khi thay đổi cấu tạo hình học của bộ phối trộn (nitrit 500ppb, thời gian tiêm mẫu 30s x 1,90ml/phút, chiều dài bộ phối trộn 100cm).
Hình 20: Tín hiệu khi thay đổi hình dạng của bộ phối trộn (nitrit 500ppb, thời gian tiêm mẫu 30s x 1,85ml/phút, chiều dài bộ phối trộn 100cm).
Với kiểu thắt nút, pic cĩ cường độ cao hơn hai trường hợp cịn lại (hình 19 và 20).
cho rằng, hình dạng của pic sẽ thay đổi rất đáng kể khi thay đổi cấu tạo hình học của bộ
phối trộn, như cĩ thể thấy tron hình 21[2].
Hình 21: Hình dạng của pick hi thay đổi cấu tạo hình học của bộ phối trộn (trích từ
tài liệu tham khảo [2]).
Kết quả trên hình 19 lại cho thấy hình dạng của pic khơng cĩ sự thay đổi đáng kể
khi thay đổi hình học của bộ phối trộn. Bộ phối trộn kiểu thắt nút cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên với ống teflon đường kính trong 1,0mm khá lớn, hình dạng thắt nút làm cho
ống bị gập hoặc gãy. Do vậy, chúng tơi đã chọn kiểu cuốn làm hình dạng của bộ phối trộn. Kiểu cuốn cĩ thể làm thành vịng trịn hoặc cuốn lên trên một vật hình trụ đều khơng ảnh hưởng đến độ nhạy.
1.3. Độ phân tán và độ bành rộng:
Độ phân tán: Trong một hệ FIA tiêu biểu: mẫu được đưa vào hệ thống qua một van tiêm mẫu (hình 1). Hệ FIA trong đề tài này, mẫu được đưa vào hệ thống bằng chính bơm nhu động. Sự tiêm mẫu như vậy sẽ giúp đơn giản hệ thống FIA, khơng cần chi phí cho van tiêm mẫu. Bằng cách khống chế thời gian tiêm mẫu chính xác cĩ thể tiêm
được những lượng tiêm chính xác giữa các lần tiêm. Lượng mẫu được đưa vào hệ
thống FIA theo cách này là rất lớn, do vậy về nguyên tắc sẽ làm cho độ phân tán của hệ
thống sẽ nhỏ. Độ phân tán nhỏ nghĩa là độ nhạy sẽ cao. Sự phụ thuộc của độ phân tán vào thời gian tiêm mẫu được cho trên hình 22. Trong đĩ cho thấy thời gian càng lớn
0.5 1.0 1.5 2.0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 thời gian (sec) D
Hình 22: Ảnh hưởng của thời gian tiêm mẫu tới độ phân tán (coil: 100cm x 1,0mm id, tốc độ 1,90ml/phút)
Độ bành rộng trong FIA
khơng quan trọng miễn là nĩ được giữ hằng định giữa các lần phân tích. Tuy nhiên, độ bành rộng càng lớn thì thời gian phân tích càng lâu. Trong hệ thống FIA tự tạo này, độ bành rộng dao động trung bình từ 1 – 2 phút. Để giảm độ
bành rộng, tức là giảm thời gian phân tích cho một mẫu cần tăng tốc độ bơm. Tuy nhiên, phản ứng giữa nitrit và các thuốc thử cần
thời gian diễn tiến, nếu tốc độ bơm quá lớn sẽ khơng bảo đảm thời gian phản ứng. Vận tốc bơm được tối ưu thơng qua hình 48.
Kết quả cho thấy với tốc độ bơm thấp từ 1,3 - 1,50ml/phút thì đạt độ nhạy tốt nhất.
2. Mạch điện tử nhận tín hiệu:
2.1. Photodiod và LED:
Hình 23: Phổ phát xạ của LED 2SGY560 và phổ
Đặc điểm của phẩm màu azo tạo thành trong phản ứng của thuốc thử với nitrit cĩ phổ hấp thu với cực đại hấp thu tại bước sĩng 540nm. Photodiode cĩ phổ với bước sĩng hấp thu theo cường độ dịng cực đại với cực đại tại 560nm như cĩ thể thấy trong hình 23:
Khoảng tuyến tính của photodiode này cũng rất rộng, cĩ thể thấy như trong hình dưới (hình 24). Với cường độ phát xạ cực đại của LED khoảng 810 mcd hồn tồn nằm trong khoảng tuyến tính của photodiode.
Hình 24: Độ tuyến tính của dịng điện thu được theo cường độ chiếu xạ vào BPW21
Độổn định nhiệt độ của photodiode này cũng khá tốt trong khoảng từ 200C – 400C (nhiệt độ trung bình trong điều kiện phịng thí nghiệm) như cĩ thể thấy trong hình 25
Như vậy sự lựa chọn phototdiod và LED là rất tương thích. Điều này bảo đảm cho
độ nhạy và độ chọn lọc của thiết bị.
2.2. Mạch lọc nhiễu tích cực tần số thấp (active low – pass filter):
Một trong những vấn đề quan trọng của đo lường là nhiễu. Trong đề tài này, nhiễu
được lọc bằng mạch lọc nhiễu tích cực (hình 8). Tác dụng khi cĩ và khơng cĩ tụ C = 1000pF (hình 26).
Ngồi việc lọc nhiễu bằng mạch lọc tích cực, chúng tơi cịn thực hiện sự lọc nhiễu bằng thuật tốn biến đổi fourier ngược được tích hợp trong phần mềm xử lý tín hiệu sẽ được trình bày trong phần sau.
Hình 26: Tín hiệu sau khi cĩ tụ lọc và khơng cĩ tụ lọc (nitrit 200ppb, thời gian hút mẫu 10, 20, 30s x 1,90ml/phút)
2.3. Modun biến đổi tương tự/số và ngược lại:
Modun PMD1208LS cĩ thể cho phép đọc dữ liệu với tốc độ 1000 mẫu/giây với độ
phân giải 12bit. Trong đề tài này: tốc độ đọc mẫu cũng được phần mềm thay đổi. Khi tốc độ đọc càng cao, nhiễu càng lớn. Cho ứng dụng này, tốc độ đọc 100 mẫu/giây là
đủ. Sơ đồ nối dây của board mạch nhận tín hiệu vào modun đã được mơ tả trong hình 11.
Nguồn cấp cho LED hoạt động được lấy trực tiếp từ chính modun PMD1208LS với
điện thế thay đổi từ 0 – 5V. Nhờ vậy cĩ thể thay đổi được cường độ chiếu của LED, chúng tơi đặt điện thế 4,5V cường độ dịng cực đại 25mA (cường độ dịng cao nhất từ
PM1208LS nếu gắn vào máy PC, cịn nếu gắn vào máy laptop là 10mA) cấp cho LED hoạt động.
Giá trịđo lường là độ hấp thu của dung dịch đi qua tế bào dịng chảy. Giá trịđộ hấp thu bằng –logarit độ truyền qua. Do vậy về nguyên tắc cần dùng thêm một IC lấy logarit như các máy UV/VIS thơng thường. Tuy nhiên, IC logarit khơng thơng dụng ở