1. 2 Đánh giá tương đương sinh học bằng nồng độ
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. So sánh tốc độ phĩng thích In vitro
Thử nghiệm phĩng thích dược chất được thực hiện theo hướng dẫn của FDA[30]: Các viên được thử trong 900 ml nước cất ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC; với thiết bị cánh khuấy với tốc độ 50 vịng/phút. Mẫu được lấy cách mỗi giờ
đến khi lượng dược chất phĩng thích trên 80%.
Ở mỗi thời điểm quy định, lấy chính xác 10 ml dung dịch thử, thêm 25 ml nước cất, 5 ml dung dịch acid acetic 25% và 0,1 ml dung dịch kali sulfat bão hịa. Định lượng bằng dung dịch AgNO3 0,01N. Điểm tương đương được xác định bằng bước nhảy thế. Song song tiến hành với mẫu trắng [7].
1 ml dung dịch AgNO3 0,01N tương đương 0,7455 mg kali clorid.
Thử nghiệm được thực hiện trên 12 đơn vị thuốc thử nghiệm (Viên nén Kali clorid 600 mg phĩng thích kéo dài) và 12 đơn vị thuốc đối chiếu (viên Kaleorid® LP 600 mg)
Ngồi ra, viên cịn được thử trong mơi trường pH 1,2 và pH 6,8; khi đĩ phương pháp ISE được dùng để định lượng ion kali cĩ trong mơi trường thử
và sau đĩ tính ra lượng kali clorid.
Hệ số f2 được ứng dụng để so sánh sự tương đồng về tốc độ phĩng thích hoạt chất giữa 2 sản phẩm: tốc độ phĩng thích được xem là tương đương nhau khi giá trị f2 trong khoảng 50 -100. Hệ số f2 được tính theo cơng thức :
− + = − = ∑( ) 100 1 1 log 50 5 , 0 1 2 2 Rt Tt x n x f n t (1) Rt : giá trị trung bình phần trăm dược chất phĩng thích của mẫu thử tại
thời điểm t
Tt : giá trị trung bình phần trăm dược chất phĩng thích của mẫu đối chiếu tại thời điểm t
t : thời điểm lấy mẫu
2.2.2. Đánh giá tương đương sinh học in vivo
2.2.2.1. Mơ hình nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện theo mơ hình thử nghiệm ngẫu nhiên, liều đơn, chéo đơi, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn.
- Người tình nguyện
Hai mươi bốn người tình nguyện khoẻ mạnh, phái nam đã tham gia vào thử
nghiệm. Người tình nguyện đã được phổ biến về mục tiêu nghiên cứu, cách cho uống thuốc, thời gian lấy mẫu dịch sinh học, số lượng và lượng mẫu mỗi lần lấy và các tác dụng phụ cĩ thể xảy ra khi tham gia thử nghiệm.
Tiêu chuẩn chấp nhận tham gia nghiên cứu
Người tình nguyện tham gia vào nghiên cứu là người khoẻ mạnh, phái nam, thể trạng và sức khoẻ bình thường căn cứ vào kết quả khám sức khoẻ tổng quát và xét nghiệm các thơng số sinh hố căn bản gồm:
Nhịp tim Huyết áp
SGOT SGPT
Điện tim Kali huyết Creatinin huyết Creatinin niệu
Cân nặng và chiều cao phải phù hợp trong giới hạn bình thường; chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index – BMI) phải trong khoảng 18-25.
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Cĩ các dấu hiệu bệnh lý về thận, tiêu hĩa, tim mạch, gan, thần kinh hoặc rối loạn thận-tụy.
- Cĩ dấu hiệu bất thường về thể chất và các thơng số sinh học.
- Hiện đang hút thuốc hoặc đã từng hút thuốc trong thời gian 6 tháng trước thử nghiệm.
- Sử dụng các thuốc cĩ tính chất kích thích hoặc ức chế men trong thời gian 30 ngày trước thử nghiệm.
- Cĩ tiền sử nghiện rượu.
- Cĩ tiền sử quá mẫn với dược chất hoặc các chất tương tự.
- Sử dụng các thuốc kê toa hoặc khơng kê toa trong thời gian 2 tuần trước thử nghiệm.
Các khuyến nghị đối với người tình nguyện [30], [32]:
Khơng nên cĩ các hoạt động thể chất mạnh trong thời gian 7 ngày trước thử nghiệm và trong thời gian thử nghiệm.
Khơng uống các thức uống cĩ cồn 48 giờ trước khi dùng thuốc và trong thời gian thử nghiệm.
Khẩu phần ăn và điều kiện sinh hoạt
Người tình nguyện được dùng khẩu phần ăn tương đối giống nhau đã được tiêu chuẩn hĩa theo bảng nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị cho người Việt Nam do Viện dinh dưỡng ban hành [5], [6] và theo hướng dẫn cho thuốc thử nghiệm là kali [30], [32].
Người tình nguyện phải uống 3,7 lít nước/ngày để đảm bảo cĩ thể bài tiết đủ lượng nước tiểu cho nghiên cứu. Lượng nước này thường cao hơn lượng nước uống bình thường trong ngày (1,3-2,5 lít/ngày).
Người tình nguyện phải ở trong điều kiện cĩ điều hịa nhiệt độ trong suốt thời gian thử nghiệm, càng ở trong nhà nhiều thì tốt. Cần hạn chế các hoạt động thể lực để tránh đổ mồ hơi.
Các bữa ăn được phục vụ vào những khoảng thời gian đã định trước.
v Dùng thuốc
Mỗi người tình nguyện phải uống 10 viên Kali clorid phĩng thích kéo dài cĩ hàm lượng 600 mg tương đương 10 x 8 mEq [30], [32]
Các mẫu nước tiểu sẽ được lấy trước và sau khi dùng thuốc để xác định kali căn bản và lượng kali bài tiết qua nước tiểu. Thanh thải creatinin được xác định để đảm bảo rằng lượng nước tiểu thu thập được là đầy đủ.
v Thu thập mẫu nước tiểu - máu
Người tình nguyện được yêu cầu cung cấp các mẫu nước tiểu vào bình chứa cĩ ký hiệu riêng của từng người và từng phân đoạn. Thể tích nước tiểu ở mỗi phân đoạn trên người tình nguyện sẽ được ghi nhận bởi 2 nhân viên của nhĩm nghiên cứu. Các mẫu nước tiểu phải được trích ra một phần để được định lượng nồng độ ion kali ngay trong ngày thu thập mẫu nước tiểu. Sau khi lấy mẫu phân tích, tất cả các mẫu nước tiểu của từng người tình nguyện sẽ được tập trung lại (thể tích nước tiểu thu được trong 24 giờ) để phân tích creatinin niệu. Trường hợp phải để lâu, các mẫu phải được trữở nhiệt độ -25 oC cho đến khi phân tích. Thời điểm lấy mẫu nước tiểu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng thu thập mẫu nước tiểu của NTN ở từng phân đoạn Từ giờ- đến giờ Phân đoạn tính theo thời điểm uống
thuốc (giờ – giờ) Thể tích nước tiểu (ml) 7-8 0-1 8-9 1-2 9-11 2-4 11-13 4-6 13-15 6-8 15-17 8-10 17-19 10-12 19-21 12-14 21-23 14-16 23 - 7 giờ sáng hơm sau 16-24 2.2.2.2. Thiết kế nghiên cứu
Theo mơ hình chéo đơi, nghiên cứu được thực hiện trong 2 giai đoạn, thời gian nghỉ giữa 2 lần dùng thuốc là 7 ngày. Mỗi giai đoạn gồm 3 ngày (72 giờ) được phân bổ như sau:
Ngày 1 (Ngày xác định kali căn bản): Người tình nguyện đến nơi nghiên cứu vào lúc 6 giờ. Người tình nguyện được yêu cầu loại bỏ tồn bộ phần nước tiểu trong cơ thể. Người tình nguyện uống 500 ml nước vào 7 giờ sáng, và uống 200 ml nước cách mỗi giờ cho đến 23 giờ. Người tình nguyện bắt đầu cung cấp mẫu nước tiểu vào lúc 7 giờ sáng theo bảng 2.1.
Ngày 2 (Ngày uống thuốc nghiên cứu): Người tình nguyện uống 10 viên Kali clorid 600 mg PTKD hoặc 10 viên Kaleorid® vào lúc 7 giờ với 500 ml nước, người tình nguyện được yêu cầu uống 200 ml nước cách mỗi giờ cho đến 23 giờ. Người tình nguyện bắt đầu cung cấp mẫu nước tiểu từ 7 giờ sáng theo bảng 2.1.
Ngày theo dõi tình trạng sức khỏe người tình nguyện và xác định kali bài tiết trong 48 giờ (ngày 3): Người tình nguyện tiếp tục uống nước và cho mẫu nước tiểu tương tự ngày 1. Người tình nguyện rời khỏi nơi nghiên cứu sau khi lấy mẫu nước tiểu cuối cùng vào lúc 7 giờ sáng hơm sau theo bảng 2.1.
Một mẫu máu 3 ml được lấy vào khoảng 14 giờ để xác định creatinin huyết và thanh thải creatinin.
Một mẫu phân được lấy ở lần đi tiêu gần nhất sau khi uống thuốc để tìm máu trong phân.
Người tình nguyện phải giữ tư thế thẳng (ngồi thẳng, đứng thẳng, hoặc đi chậm) trong khoảng 3 giờ sau khi uống thuốc.
Theo dõi dấu hiệu lâm sàng và tác dụng phụ
- Hai bác sĩ và 2 điều dưỡng túc trực thường xuyên tại phịng nghiên cứu để theo dõi phát hiện và xử lý các triệu chứng (do tác dụng phụ hoặc khơng do tác dụng phụ của thuốc) xảy ra cho người tình nguyện nếu cĩ. Để đề phịng trường hợp tăng kali huyết quá mức cĩ thểảnh hưởng đến sức khỏe người tình nguyện, điện tâm đồ được đo vào khoảng 14 giờ
(6-7 giờ sau khi uống thuốc thử nghiệm hoặc thuốc đối chiếu) trong ngày uống thuốc. Kali huyết được đo vào khoảng 14 giờ để phát hiện các trường hợp kali huyết tăng đến giới hạn nguy hiểm (nếu cĩ).
- Bản kê khai tác dụng phụ được điền bởi người tình nguyện trong 24 giờ sau khi uống thuốc thử nghiệm hoặc thuốc đối chiếu để thống kê những tác dụng phụ xảy ra nếu cĩ.
- Các mẫu phân của người tình nguyện được xét nghiêm tìm máu trong phân bằng phương pháp soi tươi để phát hiện biến chứng tại hệ tiêu hố nếu cĩ.
2.2.2.3. Phân tích nồng độ ion kali trong nước tiểu
Nồng độ ion kali trong nước tiểu được phân tích bằng phương pháp ISE (điện cực chọn lọc ion) trên máy ADVIA 1650 (Bayer).
Nguyên tắc: Mẫu thử được pha với dung dịch đệm ISE. Dịch thử này khi trao đổi qua màng của điện cực chọn lọc ion sẽ làm phát sinh điện thế. Sự thay đổi điện thế sẽ cho một giá trị chính xác từ mẫu đo [20].
Qui trình định lượng sẽ được thẩm định về tính đặc hiệu, giới hạn định lượng, độ chính xác trong ngày, độ chính xác liên ngày, độ đúng trong ngày và độ
2.2.3. Xử lý và phân tích dữ liệu thực nghiệm – xác định các thơng sốdược động học trên người tình nguyện uống thuốc thử nghiệm và