Một số hạn chế của mô, tủy xương và máu mẫu đều obta phối hợp với các bác sĩ phẫu thuật bác sĩ chuyên khoa Dr. Peter Bostick và Baton Rouge
Bệnh viện.
Mẫu được bảo quản ở -80°C sau khi đến LSU. RNA là ngay khi đến từ một phần của các mẫu máu.Các remainin mẫu được aliquoted vào lọ 2ml cryo và bảo quản ở -80 ° C.
Samp mô lớn phân chia thành các mẫu nhỏ hơn để dễ lưu trữ và ứng dụng của RNA cũ thủ tục và được lưu trữ ở -80 ° C. Mẫu xương tủy đã aliquoted vàomẫu trong ống cryo cho các thao tác sau này . Danh sách các cửa hàng mẫu
GeneLab đóng băng, được thể hiện trong Bảng 1. Tất cả các mẫu được lấy từ Dr. B ca phẫu thuật của bệnh nhân ung thư vú khẳng định hoặc nghi ngờ.
Bảng 1. Danh sách các mẫu nhận tại LSU Trường Thú y
có liên quan đến từng bệnh nhân. Một trường hợp trên T là mẫu mô, ln biểu thị bạch huyết .mẫu nút, un là cho mẫu không xác định, bts là cho các mô vú, btm là khối u mẹ .
Một trường hợp trên BM biểu mẫu tủy xương, l là cho trái và r là cho đúng hút.Một trường hợp trên BD là cho mẫu máu.Ví dụ, mẫu tủy xương số 713.328 quyền được xác định là 713328BMr.
Bảng 2 bao gồm danh sách các mẫu từ bệnh nhân xác nhận có di căn ung thư vú. Bảng2. Các mẫu có nguồn gốc được biết đến
RNA Extraction
Tổng số RNA đã được phân lập từ 0,65 cm khối của mẫu mô, từ 0,25 ml máu và mẫu tủy xương sử dụng Hoàn toàn RNA RT-PCR Miniprep Kit từ Stratagene (La Jolla, California). Hệ thống Hoàn toàn RNA đơn giản hoá guanidin truyền thống Phương pháp thiocyanate bằng cách sử dụng một ma trận silica dựa trên một định dạng spin-cốc.Sau lý giải và đồng nhất của các mẫu lâm sàng với hỗn hợp dung giải Buffer-β-ME, homogenates đã qua lọc sơ Cup spin bằng ly tâm ở tốc độ tối đa để loại bỏ hạt và nhiều các nhiễm DNA. Các các bộ lọc đã được pha trộn với 70%
Ethanol, chuyển giao cho Fiber-Matrix Cup Spin (RNA ràng buộc ly spin) và kéo dài. Các RNA ràng buộc đã được rửa sạch với Luật-Salt Wash Buffer và DNase xử lý bằng giải pháp DNase (chứa DNase Tiêu hóa bộ đệm và RNase-Free DNase I). Sau nhiều lần giặt với High-Salt và Low-Salt Wash Buffers,RNA được tách rửa từ ly quay bằng Rửa giải Buffer (một sức mạnh ion đệm thấp).RNA trong bộ đệm Rửa giải đã được lưu trữ ở -80 ° C cho sử dụng trong tương lai.
Xét nghiệm RT-PCR
Real-Time lượng One-Step RT-PCR xét nghiệm được thực hiện trên TaqMan PRISM Perkin Elmer ABI 7700 thiết bị hệ thống phát hiện Sequence , cung cấp xác minh sản phẩm với mức cao nhất nghiêm ngặt và độ nhạy cho phép đọc tự động liên tục của huỳnh quang cường độ trong PCR.
Sản xuất tín hiệu là tỷ lệ thuận với việc lai của một đầu dò huỳnh quang, phục vụ để xác thực các sản phẩm PCR cũng như xác định số lượng của nó lượng tương đối so với các điều khiển được gọi nội (GAPDH, 18S, vv).Tổng cộng sáu mRNA dấu đã được thử nghiệm. Đó là: MAGE 3 (khối u ác tính kháng nguyên E 3), HER 2 / NEU (yếu tố tăng trưởng biểu bì nhân thụ 2), MGB 1 (mammoglobin 1), CK 20 (cytokeratin 20), PSA (kháng nguyên tuyến tiền liệt cụ thể), và HPR (heparanase). Độ pha loãng của RNA.
Mẫu từ một dòng tế bào đã được sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn cho các gen mục tiêu và tài liệu tham khảo nội sinh (GAPDH hoặc 18S).RNA từ dòng tế bào ung thư vú âm tính Hs578Bst (Type Collection Văn hóa Mỹ, Manassas,
Virginia) đã được sử dụng như một calibrator.Mồi và thăm dò đã được lựa chọn sử dụng phần mềm Primer Express (Applied Biosystems). Đầu dò được gắn nhãn ở đầu 5 'với các phân tử phóng 6- carboxyfluorescein (FAM) và ở đầu 3 'với các thức uống 6-carboxytetramethyl- rhodamine (Tamra) (Applied Biosystems) (Bảng 3). Bảng 3. Primer và thăm dò các trình tự của mỗi gen marker cho khuếch đại PCR thời gian thực
Khuyếch đại của một kiểm soát nội sinh (GAPDH hoặc 18S) được thực hiện để chuẩn hóa các số liệu của các RNA mẫu thêm vào phản ứng.Thương mại có sẵn mồi và thăm dò đối với các gen quản gia, GAPDH và 18S, đã thu được từ Applied Biosystems.Các TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Hoá chất đó.
Kết hợp các thành phần quan trọng vào sự kết hợp tổng thể được thiết kế cho một bước RT-PCR là thu được từ Applied Biosystems. Các thông số đi xe đạp nhiệt phổ quát cùng là sử dụng cho tất cả các xét nghiệm định lượng TaqMan. Bước phiên mã ngược được thực hiện tại 48°C trong 30 phút.Polymerase (Amlitaq Gold) được kích hoạt ở 95 ° C trong 10 phút. Bốn mươi chu kỳ của RT-PCR được thực hiện, mỗi bộ gồm 95 ° C trong 15 giây và 60 ° C trong 1 phút.
Phân tích dữ liệu
Các mức độ biểu hiện gen marker trong mô, máu và tủy xương mẫu, như cũng như trong Hs578T dòng tế bào tích cực (American Loại Collection Văn hóa), được quantitated.
Định lượng tương đối với các dữ liệu từ PRISM ABI 7700 Hệ thống phát hiện trình tự (SDS) được thực hiện bằng cách sử dụng SDS 1,7 Software (Applied Biosystems). Các SDS ban đầu phần mềm phân tích các dữ liệu thu được bao gồm huỳnh quang bình thường của thuốc nhuộm phóng viên tín hiệu cho một tài liệu tham khảo nội bộ thụ động, tính toán các giá trị ΔRn và Ct, và tiêu chuẩn xây dựng đường cong. Bình thường hóa là cần thiết để sửa chữa cho những biến động do huỳnh quang để thay đổi nồng độ hoặc khối lượng.Bình thường được thực hiện bằng cách chia cường độ phát thải của thuốc nhuộm phóng bởi cường độ phát thải của Reference Passive để có được một tỷ lệ xác định là Rn (normalized phóng viên) cho một ống phản ứng nhất định. các
Tham khảo Passive là một loại thuốc nhuộm bao gồm trong 10X TaqMan Buffer và đã không tham gia khảo nghiệm 5'-nuclease.ΔRn đáng tin cậy cho thấy độ lớn của tín hiệu được tạo ra bởi các cho tập hợp các điều kiện PCR. Các giá trị này được tính như sự khác biệt giữa các Rn + giá trị, Rn của một phản ứng có chứa tất cả các thành phần bao gồm các mẫu, và các Rn-giá trị, giá trị Rn của một mẫu không phản ứng, ví dụ như thu được từ phản ứng không chứa mẫu, một số Template Control.
Để đảm bảo sự tự tin cao về mặt thống kê cấp, ít nhất ba Không Controls Template mỗi microplate đã được sử dụng.Các chu kỳ ngưỡng hoặc giá trị Ct là chu kỳ mà ở đó một sự gia tăng đáng kể về mặt thống kê trong ΔRn là đầu tiên phát hiện, nói cách khác, sự gia tăng tín hiệu kết hợp với tốc độ tăng trưởng theo cấp số nhân Sản phẩm PCR Quantitations tương đối được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp đường cong chuẩn.
Dưới đây là một Ví dụ mẫu của một đường cong chuẩn cho MAGE 3 và công thức được sử dụng để tính toán
Việc xây dựng đường cong chuẩn được dựa trên các mối quan hệ tuyến tính giữa ngưỡng chu kỳ (Ct) và nhật ký của nồng độ (ng) của một mẫu RNA.Các đầu vào Số tiền này được tính toán bằng cách sử dụng các giá trị m và b, sau đó đã được bình thường hóa chống lại Kiểm soát nội sinh (định lượng của một mRNA đích bình thường hóa cho sự khác biệt trong tổng số tiền RNA thêm vào mỗi phản ứng). Sau đó, nó đã được hiệu chỉnh bằng cách sử dụng Giá trị Hs578Bst (dòng tế bào tiêu cực từ các mô vú bình thường).microarray Atlas Nylon Nhân Mảng di động Interaction chứa 265 gen mã hóa cho phân tử tương tác tế bào-tế bào được mua từ BD Biosciences, Clontech (Palo Alto, California). Các màng cũng chứa 9 gen quản gia, chẳng hạn như ubiquitin C, tubulin alpha 1, tế bào chất beta-actin, vv, và 3 chứng âm (M13 mp18 (+) sợi DNA, DNA lambda, và pUC18 DNA).Atlas tiêu điểm Probe nhãn Kit (Clontech) được sử dụng để ghi nhãn dò và tiêu điểm
Chemiluminescent Hybridization và phát hiện Kit (Clontech) đã được sử dụng cho các thủ tục lai tạo và phát hiện theo quy định của nhà sản xuất.
Một thời gian ngắn, các hỗn hợp thăm dò đã được tổng hợp và dán nhãn trực tiếp do ngược chép tổng RNA (chiết xuất từ 00716247Tln và 5062801Tln mẫu) sử dụng tổng hợp cDNA (CDS) Primer Mix và các tiêu điểm nhãn Kit có chứa một ghi nhãn trộn với biotinylated dCTP.CDNA dán nhãn được tinh chế từ chưa hợp
nhất nucleotide biotin-dán nhãn và các mảnh vỡ nhỏ cDNA bằng cách sử dụng Atlas Nucleospin Extraction Kit.Màng được prehybridized ở 42 ° C trong 2 giờ, sau đó họ lai với các thiết bị thăm dò biotin-nhãn qua đêm ở 42 ° C bằng cách sử dụng tiêu điểm Chemiluminescent Hybridization và Detection Kit. Sau khi rửa nghiêm ngặt cao mô hình lai tạo các thiết bị thăm dò đã được phát hiện và tín hiệu đã được hình dung cả hai bởi lộ màng đến những bộ phim X-ray và bằng cách quét chúng bằng cách sử dụng AlphaEaseFC
Hình ảnh thiết bị Hệ thống (FluorChem IS-8800, Alpha Innotech, San Leandro, California).Cloning và Spotting của gen biểu hiện quá mức
Ba trong số các gen biểu hiện quá mức từ microarray (EMMPRIN_extracellular matrix metalloproteinase inducer, DSH homolog 1-như; Homolog
DVL1L1_dishevelled 1- như protein, và chất ức chế mô TIMP1_ của
metalloproteinase 1) đã được nhân bản vô tính vào vector pcDNA2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California) cho E. coli tuyên truyền và xác nhận bằng cách sử dụng trình tự mồi T7.Những đoạn nhân bản vô tính, khoảng 500 cặp base từng là khuếch đại bằng PCR. 1μl của mỗi sản phẩm PCR và tiêu cực điều khiển (H2O, λ DNA, và pUC19) đã được phát hiện trong ba lần trên màng nylon (Zeta-Probe Màng (Bio- Rad, Herculaes, California). Màng được đặt trong thiết bị UV Stratalinker 2400 (Stratagene) để Crosslink và làm bất động các mẫu DNA. màng được
prehybridized ở 42 ° C trong 2 giờ, sau đó chúng được lai với các biotin-dán nhãn đầu dò từ 5062801Tln và 00716247Tln mẫu qua đêm ở 42 ° C bằng cách sử dụng tiêu điểm Chemiluminescent Hybridization và Detection Kit. Hình ảnh X-ray được chụp.
KẾT QUẢ
Phát triển TaqMan Xét nghiệm cho chọn mRNA Markers khối u
Phát hiện và định lượng mức độ biểu hiện tương đối của nhiều khối u mRNA đòi hỏi chất lượng cao,ô nhiễm-miễn phí RNA với nồng độ thỏa đáng cho các phương pháp phân tử nhạy cảm như RT-PCR.
Trong các giai đoạn phát triển của dự án ung thư vú, nhiều phương pháp và thiết bị được sử dụng nhằm tinh sạch RNA để đảm bảo khả năng nhân lên trong kết quả RT- PCR
Kết quả tốt nhất thu được khi RNA được chiết xuất bằng cách sử dụng các kít RNA RT-PCR (Stratagene, La Jolla, California) tối ưu đặc biệt cho RT-PCR kết hợp loại bỏ DNA hiệu quả trên cột đặc biệt cho RT-PCR ứng dụngXét nghiệm RT- PCR định lượng TaqMan thời gian thực được phát triển trong sáu mRNA
Chỉ điểm khối u: (I) MAGE 3 (khối u ác tính kháng nguyên E 3); (II) HER2 / NEU (biểu bì của con người tăng trưởng yếu tố thụ 2); (III) MGB 1 (mammoglobin 1); (IV) CK 20 (cytokeratin 20); (V) PSA (kháng nguyên tuyến tiền liệt cụ thể); và (VI) HPR (heparanase). Mồi PCR và
Đầu dò TaqMan được thiết kế thông qua việc sử dụng các phần mềm Primer Express và thực nghiệm quan sát của chuỗi oligonucleotide. Trong tất cả các trường hợp các trình tự nucleotide mục tiêu dài ít hơn 200 Nu.Các biểu hiện mức độ của các gen marker so với đường cong chuẩn của các dòng tế bào được tính toán, bình thường chống lại sự kiểm soát nội sinh và hiệu chuẩn để các tế bào ung thư vú âm tính dòng Hs578Bst cho thấy một điển hình thời gian thực.
Phản ứng PCR khuếch đại như hình dung và vẽ đồ thị của phần mềm máy tính hỗ trợ trong Perkin Elmer ABI PRISM 7700 Hệ thống phát hiện Sequence.Thông thường, mạnh mẽ khuyếch đại các mục tiêu đã đạt được cho cả hai chỉ điểm khối u mRNA lựa chọn cũng như kiểm soát nội sinh (GAPDH hoặc 18S).
Hình 3. Khuếch đại âm mưu của một thời gian thực nghiệm TaqMan RT-PCR cho MAGE 3mẫu tủy xương
Bảng dưới đây cho thấy số lượng tương đối cho mỗi gen marker sáu cho các mẫu mô, máu và tủy xương cá nhân từ các bệnh nhân ung thư vú (Bảng 4, 5, 6, 7, 8, 9).
Bảng 4. số lượng tương đối của các biểu hiện gen 3 marker MAGE trong mô, máu và xương mẫu tủy của bệnh nhân ung thư vú
Bảng 5. Số lượng tương đối của các biểu hiện gen marker HER2 / NEU trong mô, máu và mẫu tủy xương của bệnh nhân ung thư vú
Bảng6. số lượng tương đối của MGB biểu hiện gen 1 marker trong mô, máu và xương mẫu tủy của bệnh nhân ung thư vú
Bảng 7. số lượng tương đối của các biểu hiện gen marker 20 CK trong mô, máu và xương mẫu tủy của bệnh nhân ung thư vú
Bảng 8. số lượng tương đối của các biểu hiện gen marker PSA trong mô, máu và xương mẫu tủy của bệnh nhân ung thư vú
Bảng9. Số lượng tương đối của các biểu hiện gen marker HPR trong mô, máu và xương mẫu tủy của bệnh nhân ung thư vú.
Chỉ có ba trong số các bệnh nhân đã có tất cả ba loại mẫu(mô, máu và xương tủy) có sẵn.
Bảng 10 cho thấy kết quả của MAGE 3 biểu hiện tương đối cho rằng ba bệnh nhân ung thư vú với mô, máu và các mẫu tủy xương.
Bảng10. MAGE 3 biểu hiện trong các mô, máu và tủy xương của bệnh nhân mẫu biết là có ung thư vú
R và l - phải hoặc trái xương hút tủy ** Không có mẫu sẵn
Lựa chọn khác Genes mRNA khối u Marker qua sử dụng Micro-mảng đốm Với gen tham gia vào Cell-cell tương tác Một tập hợp các thiết lập ban đầu của chỉ điểm khối u đại diện bề mặt tế bào biểu hiện protein và kháng nguyên
glycoprotein. Do đó, nó đã được quan tâm để kiểm tra tế bào khác bề mặt thể hiện kháng nguyên là chỉ điểm khối u mRNA tiềm năng.
Với mục đích này, microarray thương mại sẵn có chứa các gen mã hóa cho các protein tham gia vào cell- tương tác tế bào đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng mRNA nhãn từ mẫu khối u cụ thể. hai mô mẫu, trong đó có mức độ biểu hiện tương đối cao của MAGE 3 và gen HER2 / NEU đã được sử dụng trong các thí nghiệm microarray với Atlas Nylon Nhân Mảng di động tương tác chứa 265 gen (Clontech, Inc). Các mảng chứa nhiều gen vệ sinh phục vụ như kiểm soát nội bộ, cũng như gen phục vụ như kiểm soát tiêu cực (xem liệu và phương pháp). Đầu dò Biotin-dán nhãn đã được chuẩn bị từ 00716247Tln và 5062801Tln bạch huyết mẫu nút của hai bệnh nhân ung thư vú.
Hình 4A cho thấy các bức ảnh của microarray sau lai sử dụng nhãn cDNA dò thu được từ các 0071624Tlnmẫu khối u. Hình 4B cho thấy hình ảnh X-ray của
microarray lai với một thăm dò được thực hiện từ mẫu 5062801Tln. Cả hai con số cho thấy một số lượng tương đối gen biểu hiện quá mức như dấu chấm dày chỉ bằng một mũi tên.
b
Hình 4. Những gen chip lai với mẫu hạch bạch huyết. A. cDNA microarray là lai với đầu dò biotin-dán nhãn chuẩn bị từ RNA của 0071624Tln mẫu. B. cDNA microarray được lai với đầu dò biotin-dán nhãn chuẩn bị từ RNA của 5062801Tln mẫu. Các mũi tên chỉ ra các gen tương đối rộng quá mức. Các địa điểm của hiện quá mức EMMPRIN, DVL1L1, và TIMP 1 gen được biểu thị bằng màu xanh lá cây, xanh da trời, và mũi tên màu đỏ tương ứng (tên đầy đủ của các gen trong Bảng 10) (Hình tiếp theo)
Đầu sáu của các gen biểu hiện quá mức cao phát hiện như là một kết quả của các thí nghiệm microarray được liệt kê trong bảng 11. Sáu gen đã được tìm thấy quá mức trong cả hai thí nghiệm lai microarray.
Bảng 11. Các tên đầy đủ và tên viết tắt của một số gen cao quá mức trên cả hai Microarray
Sản xuất Macroarrays In-house for Genes chọn Là một phần của các nghiên cứu khả thi cho việc đánh giá các tiềm năng tương đối của chẩn đoán thủ tục để phát hiện các dấu hiệu của khối u mRNA, nó là cần thiết để đánh giá xem tùy chỉnh được thực vĩ mô và vi mạng có thể được phát triển.
Với mục đích này, ba gen, đã được đánh giá cao quá mức trong cả hai thí nghiệm lai tạo đã được lựa chọn cho tùy chỉnh đốm trên màng nylon.Một trình tự
nucleotide của mục tiêu khoảng 500 các căn cứ từ mỗi gen được khuếch đại sử dụng cặp mồi PCR cụ thể, nhân bản vô tính thành plasmid vector cho E. coli tuyên