- Địa điểm nghiên cứu:
c.Nhuộm các tiêu bản mô bệnh họ
** Nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin:
Dùng lam sạch để vớt các lát cắt của mẫu (dày 5-6µ) nổi trên mặt nồi nước ấm (450C) có bổ sung albumin từ lòng đỏ trứng gà. Đặt lam mẫu này lên máy sấy ở
nhiệt độ 45-600C trong 1-4h (tùy theo nhiệt độ). Đầu tiên các lam mẫu được làm mất paraphin bằng cách nhúng trong xilen 2 lần, 5 phút cho mỗi lần. Sau đó mẫu được làm no nước bằng cách nhúng trong cồn etanol với các nồng độ giảm dần (100%, 90%, 70% và 50%), mỗi mức cồn giữa trong 2-3 phút. Sau khi đã no nước, các lam mẫu được nhúng với nước vòi 3-6 lần rồi nhuộm với Hematoxylin trong thời gian 4-6 phút, sau đó lấy mẫu ra rửa với nước vòi trong thời gian 4-6 phút trước khi nhuộm lần 2 với Eosine trong 2 phút. Tiếp tục làm mất nước của mẫu bằng cách nhúng 10 lần các lam mẫu trong dung dịch cồn với nồng độ tăng dần (50%, 70%, 90%, 95% và 100%). Cuối cùng làm trong bằng cách nhúng các lam mẫu trong xilen 2 lần, 2-3 phút cho 1 lần. Để lam mẫu khô tự nhiên trong không khí, đậy bằng lamel với keo dán Bomcanada. Các tiêu bản mô bệnh học được quan sát dưới kính hiển vi quang học và xác định những biến đổi trong tổ chức dựa vào sự so sánh với mẫu làm từ cá khỏe.
** Nhuộm các tiêu bản mô bệnh học theo phương pháp của Ziehl-Neelsen
Để nhuộm các tiêu bản mô bệnh học theo phương pháp của Ziehl-Neelsen, cũng cần thực hiện các bước nhuộm như đã mô tả ở mục 2.2.3.b. Tuy nhiên, trước khi nhuộm sấy các lam mẫu bằng nhiệt (sấy mẫu ở 45oC), làm mất paraphin bằng cách nhúng trong xilen 2 lần và no nước mẫu bằng cồn (nồng độ cồn thấp dần). Sau khi đã nhuộm xong cũng phải làm mất nước mẫu bằng cồn (nồng độ cồn tăng dần) và làm trong mẫu bằng cách nhúng trong xilen 2 lần. Ngoài ra cần phải đậy mẫu bằng lamel với keo dính là bomcanada trước khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Mẫu cá bệnh và cá khỏe được giải phẫu Gắn tiêu bản bằng bomcanada Đọc tiêu bản trên kính hiển
vi quang học. So sánh biến đổi mô học của cá bệnh và cá khỏe
Cố định mẫu trong dung dịch Bouin 24h và giữ mẫu trong cồn 70% Xử lý mẫu và thấm paraphin Đúc mẫu Cắt mẫu bằng microton (5-6µ) Nhuộm bằng Hematoxyline và Eosin hoặc Ziehl-Neelsen
Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học ở cá xương
2.2.5 Thí nghiệm cảm nhiễm ngược với chủng vi khuẩn đã phân lập được từ cá bệnh bệnh