2 .T NG QUA NV VI KH UN GÂY B NH TRểN NGI
2.2.5. nh danh
Sau khi ti n hành các th nghi m trên chúng tôi ti n hƠnh đnh danh b ng ph ng pháp
sinh hóa cho các ch ng có ho t tính cao theo khóa phân lo i Cowan và Steel (Barrow và cs., 2004), khóa phân lo i Bergey (Holt và cs., 2000).
Nhu m Gram (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
S khác nhau gi a vách t bào Gram (+) và Gram (-) làm cho kh n ng b t màu màng t bào v i thu c nhu m khác nhau gi a hai nhóm vi khu n. D a vƠo đ c đi m
KHÓA LU N T T NGHI P V T LI U VẨ PH NG PHÁP
Ti n hành đ c trình bày m c 2.3.3.4
Th nghi m catalase (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
Các vi sinh v t hi u khí và k kh́ tùy Ủ đ có enzym catalase (tr Streptococcus spp.). Catalase th y phân hydrogen peroxidase H2O2 thành H2O và O2. S th y phân hydrogen peroxidase s gi i phóng O2 đ c ghi nh n qua hi n t ng s i b t khí, d a
vƠo đ c t́nh nƠy đ th kh n ng sinh enzym catalase c a vi khu n. Ti n hành
Dùng que c y l y m t ít sinh kh i t khu n l c thu n đ t lên m t phi n kính s ch, nh m t gi t H2O2 5% lên sinh kh i vi sinh v t trên phi n kính và quan sát. Vi khu n sinh catalase s s i b t kh́, ng c l i không th y hi n t ng.
Th nghi m oxidase (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
Các lo i vi khu n hi u khí tuy t đ i có enzym oxydase (cytochrom oxydase). Có th phát hi n oxydase b ng cách s d ng thu c th là gi y t m N ậ Dimethel ậ
paraphenyldiamine. Ti n hành
- Dùng qua c y vòng l y vi khu n trong đ a vi khu n đư nuôi c y, ph t lên gi y t m thu c th . c k t qu trong vòng 30 giây ậ 1 phút.
- Ph n ng oxydase (+): gi y t m thu c th chuy n sang mƠu t́m đen.
- Ph n ng oxydase (-): gi y t m thu c th v n gi màu tr ng đ c. Indol (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011))
Nguyên t c
Tryptophan là m t acid amino có th b chuy n hóa thành d ng ch y u: indol, skatole (methyl indol), acid indol acetic (IAA) b i enzym tryptophanase t vi sinh v t. C u trúc pyrrole c a indole s k t h p v i para-Dimethylamino-Benzaldehyde (DMABA) trong thu c th Kovacs’ t o thành h p ch t quinone ć mƠu t́m đ .
- C y vi khu n vƠo môi tr ng pepton l ng, 37oC/ 24 gi . Nh 5 gi t thu c th
Kovacs’ tr c ti p vào canh c y. L c nh vƠ đ yên.
- ng (+): trong vài giây, l p ti p xúc gi a môi tr ng và thu c th chuy n sang
đ .
- ng (-): không đ i màu, ch có màu thu c th .
- ng (+/-): có màu cam trên b m t môi tr ng, đ́ lƠ do skatole, lƠ h p ch t b metyle hóa, có th là ti n ch t c a indol.
- Trong tr ng h p ng (-) c n thêm 24 gi đ ki m tra l i. Amylase (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011))
Nguyên t c
M t s vi sinh v t có kh n ng ti t ra enzym amylase có tác d ng phân gi i tinh b t
thƠnh các đ ng đ n đ vi khu n d s d ng. Ph n ng nƠy đ c nh n bi t khi ta nh dung d ch lugol vƠo môi tr ng th ch nuôi c y, n u trong môi tr ng có tinh b t thì
môi tr ng s chuy n thƠnh mƠu xanh đ m. N u trong môi tr ng không còn tinh b t thì lugol s không làm chuy n mƠu môi tr ng.
Ti n hành
- Môi tr ng th ch dinh d ng b sung 0,4% tinh b t. - Ho t hóa ch ng vi sinh v t th nghi m 37oC/ 24 gi .
- Dùng t m bông vô trùng ch m d ch khu n lên đ a môi tr ng. - 37oC/ 24 gi .
- Nh lugol và xem k t qu .
Nitrate (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
M t s vi khu n có kh n ng s d ng ngu n nitrate làm ngu n hydro c ch t
trong quá trình hô h p k kh́, đ ng th i s d ng ngu n nitrate nh ngu n nit duy
nh t, do kh n ng t ng h p enzym nitratreductase. Nitrate b kh thành nitrit r i có th b kh ti p thành NH3 ho c N2
KHÓA LU N T T NGHI P V T LI U VẨ PH NG PHÁP
Acid sulfanilic không màu trong Gress A s k t h p v i nhóm NO2- t o thành mu i diazonium, acid sulfanilic b diazo hóa không màu ti p t c ph n ng v i - naphthylamine không màu t o thành h p ch t p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine có
mƠu đ . Tác nhân b i k m k t h p v i acid acetic trong thu c th s làm gi m l ng mu i diazonium do p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine k t h p v i acid acetic, d i xúc tác c a b i k m t o ra arylhydrazine có màu.
Cách ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng th ch nitrate, 37oC/ 24 gi .
- Nh tr c ti p vƠo môi tr ng nuôi c y 2 gi t Gress A, 2 gi t Gress B. - ng (+): có màu h ng đ
- ng (±): không đ i màu
- M u th không đ i mƠu, ć 2 tr ng h p x y ra: Tr ng h p 1: NO3- không chuy n thành NO2-.
Tr ng h p 2: NO3- chuy n thành NO2- r i ti p t c chuy n thành NH3 hay N2.
- Ti p t c cho b t k m vƠo môi tr ng ph n ng: - ng (+): không đ i màu
- ng (-): xu t hi n mƠu đ .
Citrate (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
M t s vi sinh v t có enzym citrat permease có kh n ng s d ng citrat trong môi
tr ng có Na. Chúng gi i ph́ng ra môi tr ng ion Na+ khi s d ng citrat, làm pH môi
tr ng gi m. ng th i nh ng vi sinh v t nƠy c ng ć kh n ng s d ng mu i
amonium vô c NH4H2PO4 làm ngu n nit , gi i phóng NH3 ra môi tr ng làm ki m
h́a môi tr ng, s thay đ i pH đ c nh n di n b ng ch th màu bromothymol blue có kho ng đ i pH t 6 ậ7,6 t ng ng v i kho ng màu t vàng - xanh l c - xanh d ng.
- C y vi khu n vƠo môi tr ng th ch nghiêng Simmon’s Citrat 37oC/ 24 gi . - ng (+): mƠu xanh d ng.
- ng (-): màu xanh l c.
Urease (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
Vài loài vi khu n có kh n ng t ng h p enzym urease do đ́ ć kh n ng phơn gi i urê thành NH3, lƠm t ng pH môi tr ng, đ c nh n di n b ng ch th màu phenolred có kho ng đ i pH 6,8 - 8,2 t ng ng v i kho ng đ i màu t vàng - đ .
Ti n hành
- C y vi khu n trên môi tr ng Christensen’s Urea 37oC/ 24 gi . - ng (+): môi tr ng t h ng chuy n sang đ cánh sen.
- ng (-): môi tr ng không đ i màu.
Voges – Proskauer (VP) (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011)) Nguyên t c
Th nghi m Voges-Proskauer d a trên s phát hi n acetoin, là s n ph m bi n
d ng cu i cùng t glucose.
Glucose th y phân thành s n ph m trung gian là acid pyruvic. T acid pyruvic, vi khu n s chuy n hóa ti p theo nhi u con đ ng khác nhau, trong đ́ m t s vi khu n s chuy n hóa ti p t c con đ ng t o thành acetoin, là ti n s n ph m c a 2,3-butanediol.
C ch ph n ng c a th nghi m VP (+):
- Glucose lên men t o acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC). - AMC + -naphtol , KOH và oxy không khí (l c) Diacetyl. - Diacetyl + nhơn guanidine trong pepton t o màu h ng đ .
- Màu c a ph n ng xu t hi n sau 2-5 phút vƠ đ m nh t sau 30 phút ậ 1gi , và - M t màu n u đ lơu h n n a.
- Th VP th nghi m trên môi tr ng canh MR - VP, thu c th s d ng lƠ - naphtol 5%, KOH 40%.
KHÓA LU N T T NGHI P V T LI U VẨ PH NG PHÁP
- C y vi khu n vƠo môi tr ng, 37oC/ 24 gi . Nh tr c ti p 0,6 mL -naphtol và 0,2 mL KOH, l c đ u trong 30 giây.
- ng (+): màu h ng đ trên b m t. - ng (-): màu vàng c a thu c th .
Các th nghi m lên men đ ng (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011))
Nguyên t c
Vi khu n s d ng ngu n đ ng s chuy n hóa thành acid pyruvic làm pH môi
tr ng gi m, quan sát s thay đ i pH c a môi tr ng d a vào ch th màu phenolred v i kho ng đ i màu 6,6 ậ8 t ng ng t vàng ậđ .
Ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng lên men đ ng c n kh o sát, 37oC/ 24 gi . - ng (+): màu vàng
- ng (-): màu h ng đ n đ
Kh n ng phát tri n 10% NaCl (MacFaddin (2000), Nguy n c L ng (2011))
Nguyên t c
Th nghi m chu đ ng mu i s d ng môi tr ng TSB (Trypticase Soy Broth), b
sung NaCl đ t o ra môi tr ng có n ng đ mu i 10%. Môi tr ng nƠy dùng đ th nghi m kh n ng t n t i c a vi sinh v t trong môi tr ng có n ng đ mu i cao. M t s ch ng Bacillus có kh n ng phát tri n đi u ki n 10% NaCl, do đ́, th nghi m này góp ph n đ nh danh vi khu n.
Ti n hành
C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 ậ 24 gi vƠo môi tr ng TSB b sung 10% NaCl, nuôi c y 37oC/ 24 gi . Kh n ng phát tri n th hi n qua kh n ng m c
đ c, lƠm đ c môi tr ng nuôi c y.
Ph n l n Bacillus là các vi khu n a m v i nhi t đ sinh tr ng t i u t 30oC
đ n 45oC, m t s loài có th sinh tr ng 65oC. M t s loƠi a l nh có th sinh tr ng và hình thành n i bào t 0oC. Kh n ng phát tri n các đi u ki n nhi t đ khác nhau góp ph n đ nh danh vi khu n Bacillus.
Ti n hành
C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 ậ 24 gi vƠo môi tr ng TSB, nuôi c y
đi u ki n nhi t đ 55oC. Kh n ng phát tri n th hi n qua kh n ng m c đ c, làm
đ c môi tr ng nuôi c y.
Ki m tra kh n ng phát tri n đi u ki n k khí (MacFaddin (2000), Nguy n
c L ng (2011)) Nguyên t c
N u là nhóm vi khu n hi u khí, nó ch có kh n ng t ng tr ng trên b m t môi
tr ng.
N u là nhóm k khí tuy t đ i, ch m c đ c ph n đáy c a ng th ch sâu.
N u m c đ c toàn b ng môi tr ng th ch sâu, là nhóm vi khu n k khí tùy nghi.
D ch khu n th nghi m:
- D ch khu n kh o sát đ t n ng đ 108 CFU/ mL. Pha d ch khu n th nghi m và so sánh v i ng ć đ đ c chu n 0,5 McFarland.
- Cách pha dung d ch chu n đ đ c 0,5 McFarland.
- chu n m c h́a đ đ c c a vi khu n th nghi m ph i đ t n ng đ 108 t bào/mL, nên dùng huy n d ch BaSO4 t ng đ ng đ đ c 0,5 McFarland hay m t huy n d ch t ng đ ng b ng m t th ng (huy n d ch latex).
- Pha đ đ c chu n d a trên nguyên t c ph n ng gi a: H2SO4 + BaCl2 BaSO4 + 2HCl
- Hút 9,9 mL H2SO4 và 0,1 mL BaCl2 t ng ng v i 3 x 108 t bào/ mL. ng
đ c chu n 0,5 McFarland ć đ đ c t ng đ ng v i s l ng vi khu n là 108 t bào/ mL ta ti p t c pha loãng. Dùng ng nghi m này l c đ u, hút l y 4 mL pha vào 8 mL
KHÓA LU N T T NGHI P V T LI U VẨ PH NG PHÁP
n c c t vô khu n, tr n đ u, b 2 mL, đ y kín. L y ng này làm ng đ c chu n 0,5 McFarland.
Ti n hành
- Sau khi pha huy n d ch vi khu n, dùng micropipette hút 100 µL d ch khu n vào
ng môi tr ng th ch sơu WB, đem vortex. 37oC/ 24 gi .
- N u khu n l c vi khu n ch m c b m t ng môi tr ng vi khu n hi u khí. - N u khu n l c vi khu n m c ph n đáy ng nghi m vi khu n k khí tuy t
đ i.
- N u khu n l c vi khu n v a m c b m t môi tr ng v a m c d c theo ng
môi tr ng th ch sơu k khí tùy nghi. 2.2.6. Ph ng pháp th ng kê s li u
Các s li u trong bƠi báo cáo đ c th ng kê b i ph n m m Microsoft Excel 2010 và Statgraphics plus 3.0.
PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N
3. K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH VÀ TH O LU N
3.1. Quan sát đ i th
3.1.1. Vi khu n n i sinh
T 18 m u cây mu ng trâu kh e m nh chúng tôi ti n hành phân l p và làm thu n
đ c 18 ch ng vi khu n n i sinh. K t qu quan sát đ i th đ c trình bày b ng 3.1.
B ng 3.1 K t qu quan sát đ i th ch ng vi khu n n i sinh
STT S m u Ngu n g c phân l p Mã ch ng Hình d ng Màu s c B m t 1 7 TT L1 M c lan,
không đ u Tr ng trong Khô
2 TT T2 Không đ u Tr ng đ c Xù xì 3 TT T3 Không đ u Tr ng đ c Xù xì 4 TT R4 Không đ u Tr ng đ c Xù xì 5 TT R5 Không đ u Tr ng, h i ng vàng Xù xì 6 11 BD L6 Tròn Tr ng đ c B́ng t 7 BD L7 Tròn, đ u Tr ng Xù xì 8 BD L8 Tròn Tr ng đ c B́ng t 9 BD L9 Không đ u Tr ng, h i chuy n sang ngà Xù xì 10 BD L10 Không đ u Tr ng đ c Nh p nhô 11 BD L11 Tròn, đ u Tr ng đ c Nh n nheo 12 BD L12 B u d c Tr ng đ c B́ng t 13 BD L13 Không đ u Tr ng đ c, B́ng t
Trong đó: ngu n g c ch ng vi sinh v t thu th p đ c đ c ký hi u theo cách th c:
tên đ a đi m l y m u(Bình D ng_BD, Tân Thành_TT) - b ph n phân l p (lá_L, thân_T).
3.1.2.Vi n m n i sinh
T 18 m u cây mu ng trâu kh e m nh chúng tôi tiên hành phân l p và làm thu n
đ c 9 ch ng vi n m n i sinh. K t qu quan sát đ i th đ c trình bày b ng 3.2 và hình 3.9 mô t vi khu n n i sinh trên môi tr ng NA và vi n m n i sinh trên môi
tr ng PDA. B ng 3.2 K t qu quan sát đ i th n m n i sinh có vòng xung quanh 14 BD L14 Tròn Tr ng xám B́ng t 15 BD L15 Tròn, nh Tr ng h i ng vàng B́ng t, xù xì 16 BD L16 Tròn, đ u Xám đ c, có vòng xung quanh B́ng t 17 BD L17 Tròn, đ u Tr ng đ c Xù xì 18 BD L18 Tròn, đ u Tr ng đ c B́ng t STT S m u Ngu n g c phân l p Mã ch ng K t qu quan sát đ i th 1 7 TT NR1
Khóm n m m c ć mƠu xanh đen, m c nhanh, có nh ng h t mƠu xanh r i xu ng
m t đ a.
2 TT NR2 Khóm n m m c ć mƠu xanh đen, nhô
KHÓA LU N T T NGHI P K T QU VÀ TH O LU N
Trong đó:ngu n g c ch ng vi sinh v t thu th p đ c ký hi u theo cách th c: tên
đ a đi m l y m u (Bình D ng_BD, Tân Thành_TT) - b ph n phân l p (lá_L, thân_T, R _R), N là ký hi u cho vi n m. 3 11 BD NL3 Khóm n m m c có màu và vân tròn gi ng