- Tổng thời gian toàn bộ quá trình thí nghiệm trên một mẫu bệnh phẩm là từ 24 giờ đến 48 giờ. Trong đó thời gian trung bình của từng công đoạn như sau:
Khử tạp mẫu Dịch 10phút
Đờm 15phút
Màng sinh tiết 12giờ
Tách chiết DNA 4giờ
PCR 2giờ
Điện di 30phút
Như vậy so với phương pháp xét nghiệm truyền thống, thời gian chờ đợi kết quả đã được giảm xuống đáng kể, thay vì từ 10-20 ngày chỉ còn 24-48 giờ. Đây cũng là một ưu điểm vượt trội của việc chẩn đoán bằng phương pháp PCR
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Thời gian phát hiện vi khuẩn qua mẫu bệnh phẩm theo phương pháp PCR rút ngắn, chỉ còn 24h-48h so với 15 – 40 ngày theo phương pháp truyền thống
1.2. Nhóm nghiên cứu đã thành công bước đầu trong việc thiết kế, chứng mình cơ sở khoa học và hoàn thiện được bộ sản phẩm là bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh NTM (MAC)
1.3. Bộ sinh phẩm thỏa mãn được các điều kiện đặt ra của đề tài là: Chất lượng, nhanh chóng, đơn giản, an toàn và thân thiện
1.4. Bộ sinh phẩm được kiểm chứng với mẫu chuẩn và mẫu bệnh phẩm cho kết quả đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100% tương đương kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn truyền thống ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. KIẾN NGHỊ
2.1. Trong khuôn khổ của đề tài, nhóm nghiên cứu đã nỗ lực làm việc và đạt được những kết quả khả quan ban đầu.
2.2. Trong tương lai, nếu được tiếp tục thực hiện, nhóm muốn hoàn thiện và triển khai bộ sản phẩm với phổ chẩn đoán rộng hơn từ 3 – 5 chủng NTM
gây bệnh phổ biến trên một lần xét nghiệm thay vì 1 hiện nay
2.3. Nâng cấp kỹ thuật chẩn đoán PCR định lượng thay vì định tính như hiện nay
2.4. Đưa thêm vào bộ sinh phẩm những tiêu chuẩn kiểm chuẩn như kiểm chứng dương và âm tính giả nhằm nâng cao hiệu suất và độ chính xác trong chẩn đoán
2.5. Đăng ký thử nghiệm bộ sản phẩm tại các cơ sở y tế nhằm xác định chính xác độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sản phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Libanore, M., Bicocchi, R., Ghinelli, F., 1992. Mixed bronchial infection due to Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-
intracellulare in an AIDS patient. Infection 20, 298– 299.
2. Huang CC, Chen JH, Hu ST, Chiou CS, Huang WC, Hsu JY, Lu JJ, and Shen GH, 2012. Combined rpoB duplex PCR and hsp65 PCR restriction fragment length polymorphism with capillary electrophoresis as an effective algorithm for identification of Mycobacterial species from clinical isolates.
BMC Microbiology 12,137.
3. Falkinham JO III, 2011. Nontuberculous mycobacteria from household plumbing of patients with nontuberculous mycobacteria disease. Emerg Infect Dis. 17:419–24.
4. Saini V , Raghuvanshi S, Talwar GP, Ahmed N, Khurana JP, Hasnain SE, Tyagi AK, Tyagi AK. (2009). Polyphasic taxonomic analysis establishes Mycobacterium indicus pranii as a distinct species. PLoS One. 16;4(7).
5. Kim BJ , Hong SK, Lee KH, Yun YJ, Kim EC, Park YG, Bai GH, Kook YH. (2004) Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpoB). J Clin Microbiol.42(3):1308-12.
6. September S. M.,V. S. Bro¨zel, and S. N. Venter (2004) Diversity of Nontuberculoid Mycobacterium Species in Biofilms of Urban and Semiurban Drinking Water Distribution Systems. Applied and environmental microbiology, 7571–7573 Vol. 70, No. 12.
7. Lopez-Alvarez R;Claudia Badillo-Lopez;Jorge F Cerna-Cortes;Ivan Castillo-Ramirez;Sandra Rivera-Gutierrez;Addy C Helguera- Repetto;Diana Aguilar;Rogelio Hernandez-Pando;Sofia Samper;Jorge A Gonzalez-y-Merchand (2010) First insights into the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from HIV-infected Mexican patients and mutations causing multidrug resistance. BMC Microbiology, 10:82 8. Thomson R, Carter R, Tolson C, Coulter C, Huygens F and Hargreaves M
mycobacteria (NTM) from a large municipal water system in Brisbane, Australia BMC Microbiology, 13:89.
9. Turenne TC. Y.,V. J. Cook,T. V. Burdz,1 R. J. Pauls,3 L. Thibert, J. N. Wolfe1 and A. Kabani (2004) Mycobacterium parascrofulaceum sp. nov., novel slowly growing, scotochromogenic clinical isolates related to Mycobacterium simiae International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1543–1551
10.Turenne TC, Tschetter L, Wolfe J, Kabani A (2001). Necessity of quality controlled 16S rRNA gene sequence databases identifying nontuberculous mycobacterium species. J Clin Microbiol, 39: 3637–3648.
11.Chimara E1,Ferrazoli L,Ueky SY,Martins MC,Durham AM,Arbeit RD,Leão SC. (2008) Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns. BMC Microbiol. 20;8:48
12.Biosafety laboratory manual 3rd edition – WHO – GENEVA 2004
13.Polly E. Parsons MD, John E. Heffner MD; Pulmonary/respiration thepary 3rd editon; Copyright © 2006 by Elsevier Inc. All rights reserved.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC TÊN VIẾT TẮT ĐƯỢC SỬ DỤNG VÀ CÁC THUẬT NGỮ
-MTB: Mycobacterium tuberculosis -NTM: Non-tuberculosis mycobacterium -MAC: Mycobacterium avium complex
-PCR: Polymerase Chain Reaction-Phản ứng khuếch đại chuỗi -DNA: Deoxyribonucleic acid
-Rev: Mồi ngược
- IFN-γ: Interferon-gamma
-Real time PCR: PCR định lượng
-Multiplex PCR: PCR đa mồi
-Sequencing: giải trình tự nucleotide
-ATSH: An toàn sinh học
-NCBI: National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học quốc gia-Hoa Kì)
(a) (b)
Chủng gốc ở trạng thái khô, lạnh được nhập về trước (b) và sau (a) khi được lấy khỏi bao bì
Cấy vạch trên đĩa peptri
Chủng gốc Avium ATCC® 25291TM (đốm trắng) được nuôi cấy trong môi trường Jansen phù hợp.
Nhóm nghiên cứu làm việc trong box thí nghiệm
Tiến hành spin trong quá trình tách chiết