L ỜI CẢM Ơ N
2.3.4. Phương pháp xác ựịnh triệu chứng lâm sàng và các ựặc ựiểm bệnh lý
* Các triệu chứng lâm sàng ựược xác ựịnh bằng phương pháp khám lâm sàng thường quy:
Theo dõi tình trạng chung của ựàn lợn, phát hiện những biểu hiện bất thường: ăn, uống, thể trạng, dáng ựi ựứng và trạng thái phân.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
* Xác ựịnh bệnh tắch ựại thể: bằng phương pháp mổ khám những lợn bị bệnh ta có thể quan sát những biến ựổi ựại thể của các cơ quan.
* Xác ựịnh bệnh tắch vi thể chúng tôi lấy mẫu và nhuộm tiêu bản theo phương pháp HE:
Các mẫu thu nhận: ruột non (3 ựoạn: tá tràng, không tràng, hồi tràng), ruột già (3 ựoạn: mang tràng, kết tràng, trực tràng), hạch màng treo ruột, phổi, gan, dạ dày, thận. Mẫu tổ chức ngâm bảo quan trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin - Eosin (HE).
- Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là ruột non (3 ựoạn: tá tràng, không tràng, hồi tràng), ruột già (3 ựoạn: mang tràng, kết tràng, trực tràng), hạch màng treo ruột, phổi, gan, dạ dày, thận. Mẫu tổ chức ngâm bảo quan trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể.
- Cố ựịnh bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm: tiến hành lần lượt theo các bước sau:
+ Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5 mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựạ đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờựể rửa sạch formol.
+ Sau ựó ựưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng trong 18 giờ, lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
+ đúc block: ựặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block ựổ nhanh parafin lỏng vào block. đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từựến khi ựông cứng và chắc là ựược.
- Cắt dán mảnh gồm:
+ Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với ựộ mảnh cắt khoảng 3 - 5 ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: sau khi cắt ựược, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
480C rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là ựược.
- Nhuộm tiêu bản:
+ Bước 1: khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 3 - 5 phút; Xylen II: 3 - 5 phút; Xylen III: 3 - 5 phút + Bước 2: khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000C: 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 700C: 1 lần Cồn 950C: 1 lần Cồn 500C: 1 lần + Bước 3: khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút.
+ Bước 4: nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản. để trong khoảng hơn 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra mầu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
+ Bước 5: nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 - 10 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 15 phút cho hết Eosin thừạ
+ Bước 6: cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000C, mỗi lọ 1 phút.
+ Bước 7: tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút. + Bước 8: gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
đánh giá kết quả
đem soi tiêu bản nhuộm dưới kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong, sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
* Xác ựịnh các chỉ tiêu huyết học: Sử dụng máy Celdym 3700.
Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kắch thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân... đếm trên toàn bộống mẫu máu xét nghệm mà không cầm tách hay pha loãng mẫụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/ộl)
+ Hàm lượng huyết sắc tố (HGB, g/l) + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %)
+ Thể tắch trung bình hồng cầu (MCV, fl)
+ Nồng ựộ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, %) + Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg)
+ Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/ộl) và công thức bạch cầu (%)