b. Chẩn đoỏn phũng thớ nghiệm:
3.4.5. Phương phỏp làm tiờu bản bệnh lý:
Từ những mẫu bệnh phẩm cú cỏc biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiờu bản để xỏc định bệnh tớch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể theo quy trỡnh tẩm đỳc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phương phỏp của Bộ mụn Bệnh lý thỳ y, trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội. Cỏc bước của quỏ trỡnh làm tiờu bản vi thể như sau:
Cố định bệnh phẩm:
Ngõm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%.
Tiến hành lần lượt cỏc bước sau:
- Rửa formol: Rửa dưới vũi nước chảy nhẹ trong 24h. - Đưa mẫu vào hệ thống mỏy chuyển đỳc mẫu tự động.
Hệ thống mỏy chuyển đỳc mẫu tự động bao gồm 12 bỡnh:
Bỡnh Hoỏ chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 Đỳc block
Đỳc mẫu bệnh phẩm trong parafin
Cắt dỏn mảnh và cố định tiờu bản
Cắt mảnh: Bằng mỏy cắt microtom
Tói mảnh: Tói lỏt cắt bằng phẳng trờn phiến kớnh trong nước ấm 480C. Sau đú để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khụ là cú thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiờu bản
Cỏc bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiờu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h
Xylen II : 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: Cho tiờu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2 lần (mỗi lần 1 phỳt)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần
Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vũi nước chảy 15 phỳt + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhõn tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiờu bản trong 5 phỳt, rửa nước. Sau đú cho tiờu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiờu bản
+ Nhuộm Eosin (nhuộm nguyờn sinh chất của tế bào) Nhỏ Eosin ngập tiờu bản khoảng 5 – 10 phỳt, rửa nước. Cho tiờu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phỳt.
+ Tẩy cồn, làm trong tiờu bản: Cho tiờu bản đi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lờn lamen rồi gắn nhanh lờn tiờu bản khi vẫn cũn xylen trờn tiờu bản. Kiểm tra tiờu bản trờn kớnh hiển vi quang học.