Chương này sẽ nghiên cứu về nhu cầu oxygen của vi sinh vật, và lượng oxygen cung cấp cho chúng. Đồng thời, trong phần này, cũng xem xét để thiết kế những quy trình sao cho tốc độ hấp thu oxygen của môi trường nuôi cấy không vượt quá tốc độ chuyển hóa oxygen của bình lên men.
Tốc độ hấp thu oxygen của môi trường nuôi cấy theo thể tích được gọi là: QO2 x, với QO2 là tốc độ hấp thu oxygen đặc trưng (the specific oxygen uptake rate) (mmoles O2 g-1 sinh khối h-1) và x là nồng độ sinh khối (g dm-3). Do đó, đơn vị của QO2 x là mmoles oxygen dm-3h-1.
Tốc độ chuyển hóa oxygen theo thể tích của bình lên men (volumetric oxygen transfer) (cũng có đơn vị là mmoles O2 dm-3 h-1) được được tính bởi công thức:
dCL/dt= KLa(C*- CL).
Nó cũng sẽ được gọi lại là nồng độ oxy hòa tan (dissolved oxygen concentration), trong suốt quá trình lên men nồng độ oxygen hòa tan không nên giảm xuống thấp hơn nồng độ oxygen hòa tan tới hạn (Ccrit) hoặc nồng độ oxygen hòa tan để hình thành nên sản phẩm tối ưu. Do đó, tốc độ chuyển hóa oxygen của bình lên men cần phù hợp với tốc độ hấp thu oxygen của môi trường nuôi cấy để duy trì nồng độ oxygen hòa tan trên mức nồng độ đặc trưng. Thùng lên men (fermeter) sẽ có một giá trị KLa lớn nhất được điều khiển (dictated) bởi những điều kiện vận hành (operating conditions) của quá trình lên men. Do đó, muốn cân bằng giữa lượng oxygen cần cung cấp và nhu cầu oxygen, trong đó nhu cầu oxygen phải được điều chỉnh sao cho phù hợp với lượng oxygen cung cấp, điều đó có thể thực hiện bằng các cách sau:
• Điều khiển nồng độ sinh khổi.
• Điều khiển tốc độ hấp thu oxygen đặc trưng (QO2)
6.1 Điều khiển nồng độ sinh khối ( controlling biomass concentration)
Mavituna vad Sinclair (1985a) đã phát triển một phương pháp để dự đoán nồng độ sinh khối cao nhất (gọi là nồng độ sinh khối tới hạn kí hiệu là xcrit) có thể được duy trì dưới điều kiện hiếu khí hoàn toàn trong bình lên men ( KLa). Do đó, xcrit là nồng độ sinh khối làm cho tốc độ hấp thu theo thể tích (QO2xcrit) bằng với tốc độ chuyển hóa tối đa của bình lên men, tức KLa (C* - Ccrit). Nếu Ccrit được xem như nồng độ oxygen hòa tan thì:
QO2 = 0.99QO2 max
Khi nồng độ oxygen hòa tan là Ccrit thì tốc độ hấp thu oxygen theo thể tích sẽ là: QO2x = 0.99QO2 max * xcrit.
Nếu nồng độ oxygen hòa tan là Ccrit,và tốc độ chuyển hóa oxygen bằng với tốc độ hấp thu, thì:
KLa (C* - Ccrit) = 0.99QO2max .xcrit (9.29)
Với giá trị KLa đặc trưng từ phương trình 9.29 giá trị xcrit có thể được tính như sau: xcrit = KLa (C* - Ccrit)/ 0.99 QO2 max (9.30).
Phương trình (9.30) cũng có thể chỉnh sửa để tính nồng độ sinh khối khi nồng độ oxygen hòa tan (CL) lớn hơn Ccrit:
x = KLa (C* - CL)/ QO2 max.
Mavituna và Sinclair đã miêu tả mô hình này qua đồ thị hình 9.20. Đồ thị phía trên miêu tả mối quan hệ giữa nồng độ oxygen hòa tan và tốc độ chuyển hóa oxygen theo thể tích trong 3 bình lên men (đường 1,2 ,3 với giá trị KLa của 3 bình lên men tăng dần), trong khi đồ thị dưới thể hiện mối quan hệ giữa sinh khối và tốc độ hấp thu oxygen đặc trưng của môi trường nuôi cấy. Trục x của hai biểu đồ được vẽ cùng một tỉ lệ. Cấu trúc trên được mô tả trong hình vẽ phía trên (hình a) cho thấy
mối liên hệ giữa Ccrit với tốc độ vận chuyển oxygen trong mỗi một hệ thống 3 bồn lên men. Cấu trúc này được làm rõ hơn ở bình bên dưới để thấy rõ mối liên hệ giữa tốc độ tiêu thụ oxygen và tốc độ vận chuyển oxygen là bằng nhau tại giá trị Ccrit. Cuối cùng, từ biểu đồ phía dưới (hình b), có thể xác định được nồng độ sinh khối (xcrit), làm tăng sự cân bằng giữa tốc độ tiêu thụ với tốc độ vận chuyển. Một lần nữa, hình này có thể được dùng để dự đoán nồng độ sinh khối lớn nhất có thể duy trì khi nồng độ oxygen hòa tan cao hơn Ccrit.
Hình 9.20: (a) Mối quan hệ giữa nồng độ oxy hòa tan và tốc độ vận chuyển oxy có thể đạt được ở 3 chất lên men khi giá trị KLa tăng dần. (b) mối quan hệ giữa nồng độ sinh khối và tốc độ tiêu thụ oxygen của một quy trình vi sinh. dCL/dt và QO2x được sử dụng cùng một tỉ lệ, từ đó xác định xcrit. (Mavituna và Sinclair,1985).
Những tác giả này (Mavituna và Sinclair,1985b) dự định chỉ sử dụng mô hình này như một phương pháp thiết kế sơ cấp. Do đó, xcrit được hiểu là giá trị lí tưởng không thể đạt được, trong thực tế, lượng oxygen giới hạn có lẽ luôn dưới giá
trị này. Cơ chế để (định ra) giới hạn nồng độ sinh khối sẽ là nồng độ giới hạn của cơ chất trong môi trường, đối với nuôi cấy mẻ, có thể xác định từ biểu thức sau:
SR = xcrit / Y
SR là nồng độ cơ chất giới hạn ban đầu và Y là nhân tố hiệu suất (yield factor) và giả sử cơ chất giới hạn bị cạn kiệt khi đi vào pha ổn định.
Kỹ thuật này cũng có thể áp dụng cho nuôi cấy lên tục và nuôi cấy fed- batch, nhưng phải hiểu rằng QO2 chịu ảnh hưởng bởi tốc độ sinh trưởng đặc trưng (specific growth rate) và sự liên quan giữa QO2 với tốc độ sinh trưởng phải được tính. Phương pháp này rất hữu dụng khi nghiên cứu sự lên men của vi khuẩn đơn bào và nấm men, tại đây sinh khối vi sinh vật không ảnh hưởng đến KLa. Tuy nhiên, trong quá trình lên men có nhớt, nồng độ sinh khối ảnh hưởng đến KLa, như thảo luận ở phần trước. Do đó, KLa sẽ giảm cùng với sự tăng nồng độ sinh khối, áp dụng kỹ thuật này sẽ gặp nhiều rắc rối hơn.
6.2 Điều khiển tốc độ tiêu thụ oxygen đặc trưng (specific oxygen uptake rate)
Tốc độ tiêu thụ oxygen đặc trưng tỷ lệ thuận (directly proportional) với tốc độ sinh trưởng đặc trưng, vậ nên khi µ tăng thì QO2 cũng tăng. Do đó, QO2 có thể được điều khiển bởi tốc độ pha loãng (the dilution in the continuous culture) trong môi trường nuôi cấy liên tục. Mặc dù rất ít lên men mang tính thương mại sử dụng nuôi cấy liên tục, nhưng fed-batch culture thì được sử dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp và cung cấp một công cụ tuyệt vời để điều khiển nhu cầu oxy. Động học (kinetic) và ứng dụng (applications) của nuôi cấy fed-batch được thảo luận trong chương 2. Kỹ thuật này được áp dụng phổ biến nhất để điều khiển nhu cầu oxygen vì nó kết nối với hệ thống bổ sung chất dinh dưỡng với mạch điều khiển feed-back (feed-back control loop), mạch này sử dụng một điện cực oxygen hòa tan như một yếu tố cảm biến (sensing element) (xem chương 8). Nếu nồng độ oxygen hòa tan giảm dưới giá trị đã cho (the set point) thì tốc độ cung cấp chất dinh dưỡng giảm (feed rate) và khi nồng độ oxygen hòa tan tăng trên mức cho phép, feed rate
có thể cũng tăng. Một điện cực pH cũng có thể được sử dụng như một đơn vị cảm biến trong mạch điều khiển feed-back để điều khiển nhu cầu oxygen- lượng oxygen giới hạn được xác định bằng cách cải thiện các điều kiện về acid. Những kỹ thuật này đặc biệt quan trọng trong giai đoạn phát triển các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong quá trình lên men của hệ sợi hơn là sản xuất sản phẩm, khi đó yêu cầu tốc độ sinh trưởng cao nhất tương xứng với tốc độ vận chuyển oxygen của bình lên men. Quá trình vận hành của hệ thống fed-batch được thảo luận trong chương 2.
7. SCALE- UP AND SCALE- DOWN
Scale-up nghĩa là mở rộng qui mô lên men, ví dụ như từ phạm vi (scale) ở phòng thí nghiệm thành quy mô xí nghiệp thí điểm (pilot plant scale) hoặc từ quy mô xí nghiệp thí điểm rộng ra qui mô sản xuất. Mở rộng quy mô nghĩa là tăng lên về thể tích (volume), và do sự khác nhau về đơn vị kích thước dẫn đến các thông số quy trình giữa hai quy mô này cũng khác nhau. Công việc của những kỹ sư lên men là mở rộng qui mô lên men mà không làm giảm hiệu suất (yield), hoặc nếu hiệu suất giảm phải xác định được các nhân tố làm giảm này và đưa ra những biện pháp chỉnh sửa thích hợp. Các nhân tố chính trong scale-up bao gồm:
i Quá trình nhân giống( inoculum development). Mở rộng quy mô có thể được hiểu là các giai đoạn bổ sung (extra stages) phải được kết hợp chặt chẽ với quá trình nhân giống. Khía cạnh này được thảo luận trong chương 6.
ii Tiệt trùng (sterilization). Tiệt trùng là một nhân tố phụ thuộc vào quy mô (vì dù ở bất kỳ quy mô nào thì vi sinh vật gây hại cho quá trình lên men phải bị tiêu diệt hoàn toàn. Do đó, khi quy mô sản xuất tăng lên, chế độ tiệt trùng phải đươc điều chỉnh theo, tiệt trùng có thể làm cho chất lượng của môi trường thay đổi. Khía cạnh này sẽ được đề cặp rõ hơn trong chương 5.
iii Thông số của môi trường. Quy mô được mở rộng cũng có thể gây ra những thay đổi của môi trường vi sinh vật. các thông số của môi trường này sẽ được tóm tắt dưới đây:
b pH
c nhiệt độ,
d nồng độ oxygen hòa tan
e nồng độ CO2 hòa tan
f bọt khí tạo thành.
Tất cả những thông số trên chịu ảnh hưởng bởi sự thông khí và khuấy trộn, liên quan tới bulk mixing và cung cấp oxygen. Điểm a, b, c và e liên quan đến sự bulk mixing, còn d, e, f và g liên quan đến dòng khí và vận chuyển oxygen. Do đó, sự thông khí và khuấy trôn có xu hướng ảnh hưởng đến scale-up. Tuy nhiên, phải luôn nhớ rằng những khó khăn của sự phát triển chủng cấy, và tiệt trùng có thể làm giảm hiệu suất và để đạt được chế độ thông khí/khuấy trộn thích hợp không chỉ là một vấn đề đơn giản.
7.1 Chế độ thông khí/ khuấy trộn trong bồn khuấy trộn của scale-up (Scale-up of aeration/agitation regimes in stirred tank reactors)
Từ danh sách các thông số môi trường chịu ảnh hưởng bởi sự thông khí và khuấy trộn, chúng ta không thể chắc chắn rằng những điều kiện lên men ở quy mô nhỏ (small-scale)thì giống hoàn toàn so với lên men ở quy mô lớn hơn(larger scale). Do đó, chỉ tiêu quan trọng nhất của một quá trình lên men đặc thù phải được xác lập, và khi lên men ở quy mô lớn phải dựa trên những đặc tính này. Vấn đề này đã được Forx mô tả rất rõ qua “scale-up window”. Scale-up window đã trình bày ranh giới của các thông số môi trường và chi phí của chế độ thông khí và khuấy đảo thể hiện trong hình 9.21
Hình 9.21: Scale-up window xác định ranh giới hoạt động cho quá trình thông khí và khuấy trộn của quá trình lên men trong quy mô lớn. Được dựng nên nhờ Fox (1978) và Lilly (1983).
Các điều kiện thích hợp của phối trộn và vận chuyển oxygen có thể đạt được bằng một loạt các kết hợp giữa sự thông khí và khuấy trộn với nhau. Hai trục của hình 9.21 là sự thông khí và sự khuấy trộn, vùng nằm trong hình lục giác thể hiện chế độ thông khí/khuấy trộn thích hợp. Ranh giới của hình lục giác được xác định bằng giới hạn của lượng sự cung cấp oxygen, sự tích trữ CO2 và shear làm hại đến tế bào, chi phí, sự hình thành bọt khí, bulk-mixing.Ví dụ, tốc độ khuấy trộn phải nằm giữa một giá trị lớn nhất và nhỏ nhất – nghĩa là việc khuấy trộn sẽ không tương xứng khi mixing dưới mức nhỏ nhất và tốc độ shear phá hủy tế bào thì quá lớn trên giá trị lớn nhất. Giớn hạn của sự thông khí được xác định có giá trị nhỏ nhất tại giới hạn oxygen và lượng CO2 tích trữ và có giá trị cao nhất tại sự hình thành bọt khí. Hình dạng của “cửa sổ” phụ thuôc vào quá trình lên men. Ví dụ sự cung cấp oxygen sẽ không thích hợp trong quá trình lên men kỵ khí, trong khi giới hạn là do shear là phần quan trọng chính trong scale-up của quá trình lên men tế bào động vật.
i Xác định được nguồn gốc của nguyên nhân làm cho phạm vi môi trường (principle environmental domain) bị ảnh hưởng bởi sự thông khí và khuấy trộn trong quá trình lên men, ví dụ hàm lượng oxygen, shear, bulk mixing.
ii Xác định được biến số quy trình (process variable) làm ảnh hưởng đến khả năng xác định phạm vi của môi trường.
iii Tính toán giá trị của biến số quy trình được sử dụng trong quy mô lớn để các điều kiện môi trường ở hai quy mô giống nhau.
Bảng 9.6 trình bày sự ảnh hưởng của biến số quy trình đến mixing và sự chuyển hóa sinh khối (của Oldshue, 1985, Scragg, 1991). Do đó, nếu nồng độ oxygen hòa tan được xác định là điều kiện môi trường quan trọng nhất thì sự tiêu thụ điện năng trên đơn vị diện tích và tốc độ của dòng khí theo thể tích trên một đơn vị thể tích nên được duy trì ở mức độ nhất định trong lên men ở scale-up. Tuy nhiên, sẽ dẫn đến một kết quả là các thông số còn lại sẽ không giống trong quy mô lớn hơn và do đó các nhân tố môi trường sẽ bị ảnh hưởng.
Bảng 9.6: Ảnh hưởng của biến số quy trình đến sự chuyển hóa sinh khối hay đặc tình đảo trộn
Process variable Sự chuyển hóa sinh khối hoặc tính chất phối trộn bị ảnh hưởng
điện năng tiêu thụ/đơn vị thể tích Lượng oxy chuyển hóa Tốc độ dòng không khí Lượng oxy chuyển hóa Tốc độ đầu cánh quạt Tốc độ shear
Tốc độ bơm Thời gian khuấy trộn
Hệ Số Reynolds (xem phần trước) Sự chuyển hóa nhiệt
Hiện tượng này được làm sáng tỏ bằng ví dụ của Oldshue, tóm tắt trong bảng 9.7, trong đó quy mô tăng 125 lần. Nếu sự tiêu thụ điện năng trên một đơn vị thể tích không đổi, thì tốc độ đầu cánh quạt tăng, và dòng min-1 vol-1( tức là mixing) giảm. Nếu mixing không đổi thì điện tiêu thụ sẽ tăng rất lớn và shear tăng 5 lần. Nếu tốc độ cánh quạt (shear) không đổi, thì điện năng tiêu thụ và mixing giảm. Sự
phân tích này cho thấy không thể giữ nguyên giá trị minxing trong scale-up, và hiệu suất giảm có thể là do mixing không ổn định (anomalies).
Bảng 9.7: Những ảnh hưởng của sự lựa chọn các chỉ tiêu điều kiện vận hành scale- up trong các bình scale-up. Dựa trên scale-up từ 80dm3 đến 104 dm3 (theo Oldshue, 1985)
Chỉ tiêu sử dụng trong
scale-up ảnh hưởng của điều kiện vận hành trong quy mô lớn(giá trị quy mô lớn/giá trị quy mô nhỏ)
P P/V Dòng min-1vol-1 NDi
P/V 125.0 1.0 0.34 1.7
Dòng min-1vol-1 3125.0 25.0 1.0 5.0
NDi (tốc độ đầu cánh
quạt) 25.0 0.2 0.2 1.0
Số Reynolds 0.2 0.0016 0.04 0.2
nồng độ oxygen và shear là hai nhân tố môi trường quan trọng nhất (enviromental domain) bị ảnh hưởng bởi thông khí và khuấy trộn. Do đó tiêu chuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong scale-up là giữ cho KLa hoặc shear không đổi. Trong scale-up để shear không đổi thì phải giữ cho tốc độ đầu cánh quạt không đổi. Để KLa không đổi thì điện năng tiêu thụ trên một đơn vị thể tích và tốc độ dòng khí theo thể tích không đổi. Các biến số vận hành thể hiện lượng điện năng tiêu thụ trong những bồn giống nhau về phương diện hình học là tốc độ máy khuấy. Tốc độ khuấy của máy khuấy trong quy mô lớn được tính toán từ mối liên quan giữa KLa với lượng điện năng tiêu thụ và giữa lượng điện năng tiêu thụ với biến số vận hành. Một ví dụ ở phần trước đã diễn tả sự ảnh hưởng của biến số vận hành đến lượng điện năng tiêu thụ.
Hubbard (1987) và các cộng sự (1988) đã tóm tắt quy trình trình lên men ở quy mô lớn bằng cả 2 phương pháp của Newton và phi Newton, cuối cùng họ đã đề xuất 2 phương pháp để xác định các điều kiện của quy mô lớn.
Phương pháp 1:
i Xác định tốc độ dòng khí theo thể tích trong quy mô lớn căn cứ vào duy trì tỉ số Q/V không đổi. (V: thể tích của bồn lên men)
ii Tính tốc độ cánh khuấy khi KLa không đổi trong quy mô lớn, dựa vào mối tương quan giữa điện năng tiêu thụ với N (biến số vận hành) và giữa KLa với lượng điện năng tiêu thụ.
Phương pháp 2:
i Tính tốc độ cánh khuấy, giữ tốc độ đầu cánh quạt cố định, NDi.
ii Tính Q từ mối tương quan giữa lượng điện năng tiêu thụ và KLa.
Các kỹ thuật này chỉ chính xác trong mối quan hệ giữa điện năng và KLa, do đó, cần