2. Đại cương về izozym
3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần thể
Phyllanthus urinaria dựa trên các dấu chuẩn izozym SOD, EST và PO
Trong 3 hệ izozym SOD, EST và PO trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.
Dựa trên các băng đồng hình và đa hình khi phân tích hệ izozym SOD từ 17 mẫu quần thể của loài p. amarus và 19 mẫu quần thể của loài loài p. urianarỉa, chúng tôi đã xác đinh đợc hệ số đồng dạng di truyền và xây dựng đợc cây quan hệ di truyền giữa các quần thể thập đợc của hai loài p. amarus
vắ P. urinaria bằng việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h. Kết quả được trình bày trên hình 18.
Từ kết quả phân tích, có thể chia các quần thể hai loài p. amarus và p. urinaria được sử dụng trong nghiên cứu này làm 3 nhóm chính. Nhóm thứ nhất bao gổm toàn bộ 17 quần thẽ p. ứtìĩãrus VỚI hộ sô tơng đong di truyen dao động trong khoảng từ 0,63 đến 1,00. Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p. urinaria (bao gồm các quần thể UBĐ, U-TC, ƯĐA, ƯCL, UHB, UpT, UTQ, UphL,
UMĐ> UHD, Ujk, UVL, U-JT, UpL) có hệ số tương đồng di truyền là 1,00 (do hoàn toàn không xuất hiện các băng điện di hệ izozym SOD). Nhóm còn lại có thể là hệ trung gian của hai nhóm trên gồm các quần thể UVY, ƯNB, U^T, và ULS.
H h - 5 I I I I I 1 11 » I » I--- Ị ~ 0,25 0,50 0,75 Hệ số tương đồng di truyền Am A«K Apt A*tĐ Ahd Avy Aln Asđ AtìĐ Ath Ađđ A*H Ayđ A+hb Acl Aoa Anb ■ U N0 I UĩhT IịỊls ■ UvY U p t UphL Ubđ UvL U t q U t x U t k Uhd Umđ U t t U p l U đ a Ucl Uhb Utđ "“ I 1,00 1— 0,00
Hình 2. Sơ đồ quan hệ df truyèn cùa 36 quần thẻ m ẫu thuộc hai loài p. am arus và p. urinaria được xác bằng kỹ thuật phân tích chì thị izozym SOD (địa điềm thu thập các mẫu được nêu trên Bảng 1)
đính
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST và PO để góp phần phân loại hai loài cây thuốc Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.và
Phyllanthus urinaria L. ngay từ khi cây còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym SOD).
2. Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng của các quần thể loài p. amarus trong nghiên cứu này có Rf= 0,63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75.
3. Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus có Rf=0,09 và Rf=0,42.
ằ . Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng của các quần thể loài p. amarus có Rf= 0,85 và Rf= 0,87.
j C Phát hiện quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di izozym SOD, EST mang các băng đặc trưng của loài p. amarus. Có thể đây là con lai giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria.
ế . Có thể sử dụng các hệ izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa dạng và khoảng cách di truyền giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria thu thập ở miền Bắc Việt Nam, trong đó hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.
ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền các loài Phyllanthus spp. và các đối tượng khác, nhằm góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu.
2. Có những nghiên cứu sâu hơn vể quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem đây có đúng là con lai giữa 2 loài hay không?
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Huy Bích và cs.(1999), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam,
tập II, Tr. 438, Nxb Khoa học kỹ thuật; Hà Nội.
2. Võ Vãn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội. 3. Trịnh Đình Đạt và cs. (1999), “Một số hệ isozym của các dòng cá rô phi - oreochromis niloticus nuôi ở Việt Nam”, Tạp chí sinh học, (23,3a),tr 167-
169.
4. Hoàng Thị Hoà, Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Biên, Trần Thị Nhuận (2004), “Xác định các dòng lúa lai bằng việc sử dụng hệ izozym esteraza”,
Tạp chí khoa học ĐHQGHN, T. XX, số 2PT.
5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Thành phố Hổ Chí Minh.
6. Nguyễn Như Khanh, Võ Minh Thứ (1995), “Tính đa hình izozym peroxidaza và esteraza của một số giống lúa chịu hạn và mặn”. Di Truyền Học và ứng dụng, số 3. tr 27-32.
7. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nơm, Nxb Y học, Hà Nội.
8. Chu Văn Mẫn, Trịnh Đình Đạt (1992), “ Tính đa dạng của các hệ isozyme ở người Việt Nam ”, Di Truyền Học và ứng dụng, số 1, tr. 11-14.
9. Đỗ Lê Thăng, Trịnh Đình Đạt (2001), “Hệ isozyme esterase của sâu tơ (plutella xylo Stella) kháng thuốc diệt”, Di Truyền Học và ứng dụng, số 4, tr. 27-30.
10. Allbert L. and Andrew u . s (1968), “Isoenzyme in biology and medicine”, Academic press, London.
11. Bancilhon, L. (1971) “Contribution a' rétude taxonomique de genre
Phyllanthus (Euphorbiacees).” Boissiera 18, 9-81; 22 plates.
12. Calixto J.B., Santos A.R., Cechinel F.V., Yunes R.A. (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential. M ed Res Rev, 18(4): 225 - 258.
13. Chan H.L., Sung J.J., Fong W.F., Chim A.M., Yung p.p., Hui A.Y., Fung K.p. Leung p .c. (2003), Double-blinded placebo-controlled study of p. urinaris for the treatment of chronic hepatitis B. Ailment Pharmacol. Ther.
18: 339 - 345.
14. Glaszmann J. c (1987), “Isozyme and classification of Asian rice varieties”, Theor Appl. Genet, 74, pp. 21-30.
15. Nguyen V. X, Yoshino H., Tahara M. (1998), “Genetic control of four enzymes indiphoid Tarro, colocasis eskulenta (L.) schott”, Breeding Science
48, pp. 273-280.
16. Rohlf F.J.(1993), NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis system version 1.80. Exeter software. Applied Biostatistics Ins.,
New York.
17. Rossignol L., Rossignol M., Haicour R. (1987), “A systematic revision and Phyllanthus Subsection Urinaria (Euphorbiaceae).” American journal and Botany, 74, 12, December, 1853-1862.
18. Syamasundar, K.V., Singh, B., Thakur, R.S., Husain, A., Kiso, Y., and Hikino, H. (1985), “Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs.”
Journal o f Ethnopharmacology 14, 41-44.
19. Tanksley S.D. and Orton T.J. (1983), Isozymes in plant genetics and breeding. Elsevier Science Publ., Amsterdam.
20. Taylor L. (2003), Chanca piedra “stone breaker" (Phyllanthus niruri).
Sage Press Inc.
21. Thyagarajan S.P., Subramanian s., Thirunalasundari T., Venkateswaran P.S., Blumberg B.s. (1988), Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus. Lancet, 2 (8614): 764 -766.
22. Venkateswaran P.S., Millman I., and Blumberg B.s. (1987), Effects of an extract from p. niruri on hepatitis and woodchuck hepatitis viruses: invivo and invitro studies. Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: 2 7 4 -2 7 8 .
23. Zimmerman W.S., Lumpkin T.A., Watanable I. (1989), Isozyme differentiation of Azolla. Euphytica 42: 163 - 170.
24.ưeno H. and et al (1988), “ Chemical and pharmaceutical studies on medicinal plants in Paraguay. Geraniin, an angiotensin-converting enzyme inhibitor from ‘paraparai m i,’ Phyllanthus mruri.”, J. Nat. Prod, 51(2), pp. 357-59.
25. Unander W.D., Webster L. G., Blumberg s. B., (1990), “Records of usage or assays in Phyllanthus (Euphorbiaceae) I. Subgenus Jsocladus, Kirganelia, Cicca and E m b lica Jo u rn a l o f Ethopharmacology 30, 233-246.
Bộ Khoa h ọc và Công nghệ HỘI ĐỔNG KHOA HỌC T ự NHIÊN
N gành Khoa học Sự sống
NHữNG VẤN ĐỂ NGHIÊN CỨU c ơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG
BÁO CÁO KHOA HỌC,
HỘI NGHỊ TOÀN QUỐC 2005
NGHIÊN CỨU Cơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG
Trường Đ ại h ọc Y Hà Nội, 03 tháng 11 năm 2005
N H À X U Ấ T B Ả N K H O A H Ọ C VÀ K Ĩ T H U Ậ T HÀ NỘI, 2005
NỌI DUNG■
N h ữ n g v ấn đ ề n g h iê n cứ u cơ b ản tro n g K hoa học S ự sống n ăm 2004-2005 v à đ ề x u ất n h ữ n g đ ịn h h ư ớ n g tiế p theo
GS.TS. N g u y ễn Bá
M ột số h o ạ t đ ộ n g và k ế t q u ả n g h iê n cứu chủ yếu về kh o a học và công nghệ
của Trường Đại học Y Hà Nội
GS.TS. N g u y ễn Lân Việt
M ột số tax o n m ớ i v à/h ay b ổ su n g cho h ệ thự c v ật V iệt N am và vấn để bảo tồ n chúng P han Kê'Lộc, N guyễn Tiến Hiệp, N guyễn Thị Thanh H ương, Đỗ Tiến Đoàn,
N g u y ễn Q u an g H iếu, Tô Văn Thảo, N guyễn Tiến Vinh, N guyễn Sinh Khang, P hạm Văn Thế, D ươ ng Thị H oàn, J. R egalado Jr., L.v. A veryanov, A.L. Averyanova D.D. Soejarto, K.D. Hill, S.K. Wu, J. Wen, A. Farjon, s. Swan, N. Furey,
N guyễn M ạnh C ường, Vũ Ngọc Long
T ổ n g q u a n các đặc điểm sin h học chủ yếu gặp ở b ệ n h n h â n ung th ư vòm m ũi họng V iệt N am . M ột số ứ n g d ụ n g lâm sàng
Phan Thị Phi Phi
N h ữ n g k ế t q u ả nổ i b ậ t của Đ ê tài n g h iê n cứu cơ b ản vê áp d ụ n g kỹ th u ật sin h học p h ầ n tử tại V iện C ông n g h ệ S in h học, v iệ n KH& CNVN
Lê T rần Bình, N ông V ăn Hải, Phan Văn Chi, Lê Q uang H uấn,
Trương Nam Hải, Đinh Duy Kháng
P a d ạ n g đ ộ n g vật và b ảo tồn n g u ồ n g en tại V ư ờ n Q uoc gia X uân Sơn - P hu Thọ T rần M inh Hợi, N guyễn Xuân Đặng, Lê Đ ình Thuỷ, N guyễn Văn Sáng, Lê Xuân H uệ
I D A DẠNG SINH HỌC■ •
V À BẢO TỒN NGUỒN GEN
K ết q u ả đ iề u tra bước đ ầu về sự p h â n b ố của k h u h ệ bò sát ở k h u bảo tồn th iê n n h iê n Bà N à - N úi C húa, th à n h p h ố Đà N ang
331. S ử d ụ n g h ệ izo zy m su p ero x id e d ism u ta za (SOD) tro n g n g h iê n cứ u đa h ìn h di tru y ền
và góp phần phân loại hai loài cây thuốc Phyllattthus amarus vả Phyllanthus urinaria
à V iệt N a m
.H o à n g Thị H òa, Đ inh Đ oàn Long, Cao Lệ Quyên, Trần Thị N huận, Phạm T hanh H uyền 332. N g h iê n cử u h a i k ỉế u tái sin h in vitro cây k h o ai lan g Ipom oea b atatas L.
N guyễn H ữ u Hổ, N guyễn V ăn U yển
333. N g h iê n cứ u tạo p h â n tử 2 chức n ă n g đ ế ứ n g d ụ n g tro n g y học Lê Q uang H uân, Vũ Thị Bích H ườ ng
334. Đ á n h giá đ a d ạ n g n g u ồ n g e n xoài V iệt N am (M angifera) sử d ụ n g kỹ th u ậ t RAPD N guyễn Thị N gọc H uệ, T rần D anh Sửu, Trịnh H ồng Kiên
335. T ách dòng, xác đ ịn h và so sá n h trìn h tự gen m ã hóa p ro tein N ib của b ố n dòng virus gây b ệ n h đ ố m v ò n g trê n cây đ u đ ủ ở V iệt N am
N guyễn M inh H ùng, C hu H oàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành 336. P h ân tích đ a h ìn h d i tru y ề n của tập đ o àn giố n g n ấm L inh C hi (G anoderm a) ở m ức độ
p h â n tử n h ằ m p h ụ c v ụ công tác tu y ể n chọn và p h â n loại giống nấm
T rần M ạnh H ùng, Đ ặng T rọng Lương, Bùi M ạnh Cường, N guyễn H uỳnh M inh Quyên 337 N g h iê n cứ u công n g h ệ lê n m e n p h y tase từ vi k h u ẩ n Bacillus subtilis
Đỗ Thị N gọc H uyền, Lê Thiên Minh, N guyễn Thuỳ Châu, Trương Nam Hài
338 Biểu hiện gen mã hóa protein vỗ virus gây bệnh viêm túi truyền nhiễm trong trứng gà
T rần Thị T hanh H uyền, Lê T hanh Hòa, Lê Q uang H uân
339. M ột số k h ác b iệ t về h o ạt độ enzym , p h ổ b ăn g p ro tein và A D N của mối
M arcrotertnes carbonarius, M . g ilvu s th u th ập ờ M ã Đà và Cát Tiên, tin h Đ ông Nai Đ ặng Q u an g H ư ng, Phạm Thị T hanh Vân, Trần Thị H uyẽn Nga,
N g u y ễn Q u an g H uy, Phan T uân N ghĩa
340. H aem ophilus influenzae T yp b: Đ ặc điểm sin h học p h â n tử, y ếu tố n g u ổ n lây m an g tín h gia đ ìn h
P han Lê T hanh H ương, Đ ặng Đức Anh, Vũ Thị Thu H ư ờ n g , Lê N hật Minh, N gô Thị Thi, T rần Q uang C ảnh, Tsuguo Sasaki
341. K hảo sát tác đ ộ n g của m ột số tác n h â n gây ức ch ế m iễn dịch lên h ệ m iễn dịch ch u ộ t n h ắ t trắ n g M us m usculus var. A lbino
P han M inh Liêm, Phạm Văn Phúc, N guyễn Thị Thúy Anh, Phan Kim Ngọc, N gô Kê'Sương
1238 1242 1246 1250 1254 1258 1262 1266 1270 1274 1278
1238
S IN H H Ọ C P H Ả N TỬ, T Ế BẢO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯ ỞNG ỨNG DỤNG
Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) trong nghiên cứu đa hình di truyền và góp phần phân loại hai
loàĩ cây thuốc Phyllanthus amarus va Phyỉianthus
urinaria ở Viêt Nam■
Hoàng Thị Hòa, Đinh Đoàn Long*, Cao Lệ Quyên, Trần Thị Nhuận
Trưởng Đại học KHTN, Đại học Quốc giá Hà Nội Phạm Thanh Huyền Khoa Tài nguyên Dược Liệu, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế
MỞ ĐẦU
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) lả
hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Euphobiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở nước ta Hai loài cây thuốc này được sử dụng từ lâu đời trong y học cỗ truyền của Việt Nam và nhiều nước Châu Á như Án độ, Malaysia, Thái lan, Campuchia, Lào, Trung Quốc, Indonesia. Các tác dụng điều trị được biết đến rộng rãi của chúng bao gồm điếu trị rối loạn đường tiêu hóa (đặc biệt là các bệnh lý về gan), bệnh tieu đường, một số bệnh về thận, đường tiết niệu (Calixto et al., 1998). Gần đây. mpt số nghiên cưu dược lý đã chứng minh các dịch chiết của Phyllanthus có tác dụng ức chế quá trình sao chép của virus viêm gan siêu vi B và các loại retrovirus khác (bao gồm cà HIV) nhờ cơ chế ức chế enzym sao chép ngược reverse transcriptaza (Thyagarajan et al„ 1988; Venkateswaran et ai., 1987; Chan et al„ 2003).
Riêng ờ nước ta, trong vài năm gần đây, nhiều biệt dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus và p. urinaria đã được sản xuất và sử dụng rộng rãi. Trong đó, có thẻ kề đến Livbilnic®(Công ty cổ phần Dược
phẩm Traphaco), VG-5® (Công ty Dược phẩm TW5), Hepaphyl® (Công ty Dược phẩm TW25), Hepamarin®, Livsin-94® (Công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây), ...
Tuy vậy, việc sản xuất các dược phẩm từ hai loài p. amarus và p. urinaria dựa trên các dược liệu thu hải tự nhiên bộc lộ một số nhược điểm như sau: (1) Việc thu hái không có quy hoạch dễ dẫn đến nguy cơ mắt đi các nguồn tài nguyên di truyền; (2) Việc thu hái từ các dạng hoanq dại không đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp dược do nguồn nguyên liệu ban đầu thường kém on định và khó kiểm soát về thành phẩn hóa học, hoạt chất sinh học; (3) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các tác nhân gây bệnh khác, vi vậy có thể mang theo các nguồn chất độc ngoài ý muốn; (4) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiêm độc với các nguồn chất độc khác nhau, chẳng hạn như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải cõng nghiệp ... nếu được Ihu hái từ các vùng bị ô nhiễm; (5) Trong thực tế, p. amarus và p. urinaria lả hai loài cây thuốc có đặc điểm hình thái rất
giống nhau và giống với một số loài Phyllanthus khác hiện đang cò ờ Việt Nam, như p. niruri, p. reticũlatus vốn ít được quan tâm hơn vi mục đích chế biến dược liệu. Trước thực tế đó, việc thu hái dược
liệu đứng trước nguy Cữ nhầm lẫn và khó có thẻ đảm bảo chất lượng cho quá trinh sản xuát dược phẩm. Nhằm góp phần cung cấp một cõng cụ phục vụ cho công tác bảo tồn, định hướng chọn tạo giống và phân loại hai loài cây dược liệu dễ nhầm lẫn này, chúng tôi tiến hành đề tài “Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) trong nghiên cứu đa hinh di truyền và góp phằn phân loại haí loài cây thuốc p. amarus và P. urinaria ờ Việt Nam".
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu thự c vật
Đẻ thu thập nguyên liệu sử dụng trong nghiên cửu, chủng tôi tiến hành bốn đợt điều tra xác định vị trí phân bổ tự nhien cua cac quằn thể hai Toài p. amarus và p. urinaria ờ một số địa phương thuộc miền Bắc. Cụ thể đợt 1 được tiến hành trong các ngày 7-8/12/2004, tại Hà Nội và Hà Tây; đợt 2 trong các ngày 2 - 3/3/2005 tại Bắc Giang và Hải Dương; đợt 3 trong các ngày 7 - 8/3/2005 tại ngoại thành Hà nội; và đợt 4 từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 tại Hà nội, Hưng Yên, Hà Tây, Hòa Bình và Vĩnh Phúc. Từ các mẫu thu được dựa vào khós phân loặi hình thái, chúng tỏi chpn ra 36 mâu có đặc điem hình thai tương đoi đi6n
hình CÙ3 hai loài cây thuốc được qusn tâm nghiên cứu, trong đó có 17 mâu thuộc loai p. amarus (được ky
NHỮNG VẤN ĐỂ N G H IÊN cứu c ơ B Ả N TRONG KHOA HỌC sự SỐNG 1239
hiệu lả A) và 19 mẫu thuộc loải p. urinaria (được kỷ hiệu là U). Danh sách, đja điểm và thời gian thu thập
các mẫu được nêu chi tiết trên Bảng 1. Phân tích đa hình izozym
Phương pháp phân tích đa hỉnh izozym được thực hiện theo qui trinh của Tansklẹy và Orton (1983) kết hợp với Zimmerman (1989) cỏ cài tiến, với các bước cơ bản như sau: (1) Chọn, cắt lấy phần lá non. rừa sạch fcẳng nước cắt, thắm
khô; (2) Cân 500 mg mẫu và chuyển vào cối sứ, bổ sung 500 111 dung dịch đệm và nghiền cho đến khi thu được