3. Nội dung nghiên cứu
3.1.Kết quả nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng tế bào chịu
TẾ BÀO CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO
3.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo
Để đánh giá khả năng thích ứng của các giống trong hệ thống nuôi cấy mô nhằm sử dụng chúng trong việc đánh giá khả năng chịu hạn cũng như mục đích chọn dòng sau này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng tạo mô sẹo của các giống nghiên cứu. Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy thể hiện ở bảng 2.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo
Giống Nồng độ 2,4 D(mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Kích thước mô sẹo(mm) ĐVN5 10 97,80 ± 0,01 2,41 ± 0,02 11 98,36 ± 0,12 2,66 ± 0,02 12 86,21 ± 0,10 2,20 ± 0,03 ĐVN6 10 98,32 ± 0,11 2,60 ± 0,01 11 98,26 ± 0,10 2,45 ± 0,01 12 85,67 ± 0,07 2,04 ± 0,01
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, tất cả các giống thí nghiệm đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên tỷ lệ tạo mô sẹo, kích thước mô sẹo của các giống đậu tương là khác nhau. Tỷ lệ tạo mô sẹo, kích thước mô sẹo lớn nhất ở giống ĐVN5 là 98,36% và 2,66mm với nồng độ 2,4-D là 11mg/l. Đối với giống ĐVN6 thì tỷ lệ tạo mô sẹo, kích thước mô sẹo lớn nhất là 98,32% và 2,60 với nồng độ 2,4-D là 10mg/l. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy
rằng, khả năng tạo mô sẹo không tỷ lệ thuận với nồng độ 2,4 D đối với cả 2 giống ĐVN5 và ĐVN6. Khả năng tạo mô sẹo và số lượng mô sẹo tạo được là những thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy nhằm sử dụng cho mục đích chọn dònư sau này.
3.1.2. Khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng ở mức độ mô sẹo
Để xây dựng quy trình chọn dòng tế bào chịu hạn thông qua thổi khô mô sẹo, cần xác định ngưỡng thổi khô mô sẹo của các giống đậu tương nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng chịu hạn của mô sẹo của các giống đậu tương bằng cách xử lý thổi khô mô sẹo ở các ngưỡng thời gian khác nhau. Sau đó, đánh giá thông qua các chỉ tiêu sau: Độ mất nước, tỷ lệ sống sót, và khả năng tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô.
3.1.2.1. Độ mất nƣớc của mô sẹo
Sau khi xử lý mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô ở các ngưỡng thời gian 0, 3, 5, 7 giờ liên tục bằng luồng khí vô trùng của box cấy, theo dõi độ mất nước của mô sẹo của các giống đậu tương nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả ở hình 3.1
Hình 3.1. Tốc độ mất nước của mô sẹo của các giống đậu tương sau xử lý bằng thổi khô
Độ mất nước của mô sẹo tăng theo thời gian xử lý bằng thổi khô ở tất cả các giống. Tốc độ mất nước cao nhất ở ngưỡng 3, 5 giờ thổi khô: sau 3 giờ thổi khô các giống mất nước từ 43,50% - 62,70%, giống ĐVN6 có độ mất nước cao nhất, ngược lai giống ĐVN5 có độ mất nước thấp hơn là 43,50%. Tuy nhiên, ở ngưỡng 5h giống ĐVN6 mất nước tới 79,54%, ngược lại ĐVN5 ở mức 7h chỉ mất tối đa 76,32%. Nhìn chung không có sự mất nước đáng kể giữa các giống nghiên cứu. Khả năng tạo mô sẹo và chịu mất mất nước của mô sẹo trong điều kiện cực đoan là thông số phản ánh khả năng chống chịu của giống ở giai đoạn mô sẹo [15]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã thu được tương tự kết quả của các tác giả khi nghiên cứu trên thuốc lá [10].
3.1.2.2. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô
Chúng tôi đã tiến hành xử lý mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô ở các ngưỡng thời gian 0 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, sau đó tiến hành chọn lọc mô sẹo chịu mất nước.
Khả năng chịu mất nước của mô sẹo được đánh giá thông qua khả năng sống sót của mô sẹo sau khi nuôi phục hồi 3 tuần. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thấy rằng, những mô bị chết thường có màu đen, nâu hoặc màu trắng, kích thước mô không thay đổi. Những mô sống sót thường có màu xanh sáng, kích thước mô đa số lớn hơn so với trước khi đem xử lý. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô là một trong những chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo ở các ngưỡng thổi khô khác nhau
Đối chứng 3 giờ 5 giờ 7 giờ ĐVN5 97,05 ± 0,09 90,09 ± 0,11 61,32 ± 0,22 21,56 ± 0,12 ĐVN6 78,02 ± 0,08 72,01 ± 0,02 23,15 ± 0,09 0
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, trong cùng một giống tỷ lệ sống sót của mô sẹo tỷ lệ nghịch với thời gian thổi khô. Tỷ lệ mô sẹo sống sót của giống ĐVN5 cao ở hầu hết các ngưỡng thổi khô, cao nhất là ngưỡng thổi khô 3 giờ (90,09%), thấp nhất là ngưỡng 7 giờ (21,56%). Tỷ lệ mô sẹo sống sống sót của giống ĐVN6 ở hầu hết các ngưỡng thổi khô đều thấp, cao nhất là ngưỡng thổi khô 3 giờ (72,01%), ở ngưỡng 7 giờ các mô chết hoàn toàn. Tỷ lệ sống sót có liên quan đến khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo. Những nghiên cứu ở lúa, thuốc lá cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi bị xử lý bởi các điều kiện cực đoan là một chỉ tiêu để đánh giá sức chịu đựng của tế bào, làm cơ sở cho việc xác định ngưỡng chọn dòng tế bào chống chịu [17], [10]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN5 có khả năng chịu mất nước tốt hơn mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN6 ở tất cả các ngưỡng xử lý bằng thổi khô.
3.1.2.3. Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo sống sót
Khả năng tái sinh của chồi sau 6 tuần nuôi cấy của các mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô được thể hiện ở hình 3.2.
Kết quả cho thấy, hầu hết mô sẹo của các giống sau khi xử lý bằng thổi khô ở các ngưỡng thời gian khác nhau đều giữ được khả năng tái sinh chồi. Mô sẹo bị xử lý ở ngưỡng thời gian là 3 giờ có khả năng tái sinh cao hơn so với đối chứng ở cả hai giống (16,14% -11,22% so với 13,35% - 10,29% của đối chứng)
Kết quả hình 3.2 cho thấy, thời gian xử lý càng dài thì tỷ lệ tái sinh chồi càng giảm. Giống ĐVN5 có tỷ lệ tái sinh chồi cao hơn so với giống ĐVN6 ở tất cả các nồng độ xử lý (16,14% ở 3 giờ, 10,17% ở 5 giờ, 6,13% ở mức 7
giờ). Giống ĐVN6 có tỷ lệ tái sinh chồi thấp (11,22% ở 3 giờ, 6,56% ở 5 giờ và mô bị chết hoàn toàn ở 7 giờ xử lý).
Từ kết quả trên thấy rằng, hầu hết mô sẹo của các giống sống sót sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô thường có khả năng tái sinh cao hơn so với những mô sẹo không qua xử lý thổi khô. Theo Lê Trần Bình và cs (1995), nguyên nhân là do khi xử lý cực đoan ở mức độ và thời gian nhất định, những tế bào mẫn cảm đã bị loại bỏ, chỉ còn những tế bào có sức sống cao hơn mới có khả năng sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [2].
Hình 3.2.Tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Từ những khảo sát về khả năng chịu mất nước và khả năng tái sinh của các giống, chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng chịu mất nước của giống ĐVN5 là 7 giờ xử lý thổi khô, ngưỡng chọn dòng chịu mất nước của giống ĐVN6 là mức 5 giờ. Tuy nhiên, để khẳng định được chắc chắn đó là ngưỡng xử lý hợp lý, có hiệu quả đối với các giống đậu tương thì cần tiếp tục theo dõi ngoài đồng ruộng, phân tích về di truyền, hóa sinh cũng như kiểm tra về khả năng chống chịu hạn của các thế hệ tái sinh từ các dòng mô chịu mất nước thu được.
Tái sinh cây là một khâu quan trọng trong hệ thống tái sinh in vitro, môi trường để tái sinh cây cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin như IAA, IBA, BAP... Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến trong môi trường tái sinh nhiều loài thực vật, các cây họ đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi [7]. Các mô sẹo sống sót thu được được đưa lên môi trường tái sinh cây MS cơ bản, bổ sung sucarose 3%, aga 0,8%, BAP(2mg/l, 3mg/l, 4mg/l), pH=5,8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái sinh cây đậu tương từ mô sẹo được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây
Giống Nồng độ
BAP (mg/l)
Tỷ lệ tái sinh cây (%) ĐVN5 2 71,26 ± 0,02 3 80,38 ± 0,08 4 67,30 ± 0,09 ĐVN6 2 64,86 ± 0,22 3 74,56 ± 0,08 4 56,08 ± 0,03 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy cả 2 giống ĐVN5 và ĐVN6 đều có khả năng tái sinh ở tất cả các nồng độ BAP. Trong đó ở nồng độ BAP là 2mg/l thì tỷ lệ tái sinh cây ở ĐVN5 và ĐVN6 là (71,26% và 64,86%), ở nồng độ BAP là 3mg/l thì tỷ lệ tái sinh là cao nhất ở cả ĐVN5 và ĐVN6 là (80,38% và 74,56%). Khi tăng nồng độ BAP lên 4mg/l thì tỷ lệ tái sinh cây lại giảm chỉ còn (67,30%-56,08%) ở giống ĐVN5 và ĐVN6. Bảng 3.3 cho thấy giống ĐVN5 có tỷ lệ tái sinh cao hơn giống ĐVN6 ở tất cả các nồng độ và cả 2
giống cao nhất ở nồng độ BAP là 3mg/l. Kết quả trên cho thấy các giống có khả năng tái sinh là khác nhau.
Từ kết quả ở bảng 3.1 và 3.3 có thể rút ra nhận xét khả năng tạo mô sẹo tỷ lệ với khả năng tái sinh. Những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thư và CS (2007) cho rằng, khả năng tái sinh cây cũng bị ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D trong giai đoạn tạo mô sẹo [21], cụ thể ở bảng 3.3 thấy tỷ lệ tái sinh cây là 80,38% đối với giống ĐVN5 và 74,56% đối với giống ĐVN6 với nồng độ 2,4 D là 11mg/l trong môi trường hình thành mô sẹo, trong khi đó tỷ lệ tái sinh cây là 62,39% đối với giống ĐVN5 và 56,08% đối với giống ĐVN6 khi nồng độ 2,4 D là 12mg/l.
Nguyễn Thị Luyện và CS (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây ở các giống đậu xanh cũng chỉ ra rằng, các giống đậu xanh nghiên cứu có tỷ lệ tái sinh cây cao nhất và số lượng chồi nhiều nhất khi cây được tái sinh trong môi trường có bổ sung 3mg/l BAP [11].
3.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ α-NAA tới khả năng hình thành và phát triển hệ rễ
α-NAA là chất kích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có tác động mạnh đến quá trình hình thành và phát triển hệ rễ ở thực vật [16]. Các cây tái sinh khi có kích thước 4-5 cm được chuyển lên môi trường tạo cây hoàn chỉnh gồm: MS cơ bản, sucrose 3%, aga 0,8%, bổ sung α-NAA (0,2mg/l, 0,3mg/l, 0,4mg/l), pH=5,8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α- NAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh được thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ ra rễ của cả giống ĐVN5 và ĐVN6 là tương đối cao ở tất cả các nồng độ NAA nghiên cứu, nhưng tỷ lệ tạo rễ cao nhất ở nồng độ NAA là 0,3mg/l ở cả giống ĐVN5 và ĐVN6 (97,20% và 94,70%). Khi tăng nồng độ NAA lên 0,4mg/l thì tỷ lệ tạo rễ ở cả giống ĐVN5 và ĐVN6 đều giảm (77,00% và 65,00%). Những nghiên cứu của chúng tôi hoàn
phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Luyện (2009), khi nghiên cứu hệ thống tái sinh qua mô sẹo trên cây đậu xanh [16].
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng hình thành rễ Giống α-NAA (mg/l) Nồng độ Tỷ lệ tạo rễ
(%) ĐVN5 0,2 85,50 ± 0,8 0,3 97,20 ± 0,6 0,4 77,00 ± 1,1 ĐVN6 0,2 82,43 ± 1,0 0,3 94,70 ± 1,4 0,4 65,00 ± 0,9
Kết quả nghiên cứu hệ thống tái sinh và chọn dòng chịu hạn ở hai giống đậu tương là ĐVN5 và ĐVN6, chúng tôi đã thu được 47 dòng mô có khả năng chịu mất nước và 123 dòng cây từ 2 giống đậu tương phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.5. Nhận xét về khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn trong hệ thống tái sinh in vitro
(1) Cả hai giống đậu tương nghiên cứu đều có khả năng tạo mô sẹo. Giống ĐVN5 có khả năng tạo mô sẹo cao hơn giống ĐVN6.
(2) Mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN5 có khả năng chịu mất nước cao hơn mô sẹo tạo ra từ giống ĐVN6 ở tất cả ngưỡng thổi khô 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ.
(3) Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khả năng tái sinh của mô sẹo sống sót sau chọn lọc ở ngưỡng 3 giờ còn cao hơn hẳn so với mô sẹo không xử lý (0 giờ).
(4) Các mô sẹo đều có khả năng tái sinh cây ở tất cả các nồng độ BAP nghiên cứu. Tỷ lệ tái sinh cao nhất ở cả hai giống ở nồng độ BAP là 3mg/l.
(5) Nồng độ NAA là 0,3mg/l cho tỷ lệ hình thành và phát triển hệ rễ cao nhất ở cả 2 giống. Đã tạo ra 47 dòng mô có khả năng chịu mất nước và 123 dòng cây xanh.
Hình 3.3. Một số hình ảnh trong chọn dòng tế bào soma có khả năng chịu hạn ở cây đậu tương
(A) Phôi hạt đậu tương dùng để tạo mô sẹo; (B) Mô sẹo hình thành từ phôi hạt đậu tương hình thành trên mô trường nuôi cấy in vitro; (C) Mô sẹo sống sót sau khi
xử lý bằng thổi khô; (D) Tái sinh chồi từ mô sẹo sống sót sau 3 tuần nuôi cấy; (E) Tái sinh chồi sau 6 tuần nuôi cấy; (F) Tạo rễ các dòng tái sinh.
B D A C E F
Hình 3.4. Một số hình ảnh cây đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước trồng ngoài đồng ruộng
(A) Dòng đậu tương chịu hạn từ giống gốc ĐVN5; (B) Dòng đậu tương chịu hạn từ giống gốc ĐVN6; (C) Hình ảnh ra hoa kết quả của dòng đậu tương chọn lọc từ giống ĐVN5; (D) Hình ảnh ra hoa kết quả của dòng đậu tương chọn lọc từ giống ĐVN6
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC DÒNG CHỌN LỌC R0 BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Khi đánh giá các giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp truyền thống người ta thường dựa chủ yếu vào sự biểu hiện các đặc điểm hình thái, năng suất và chất lượng. Tuy nhiên, bản chất sinh học phân tử của sự thay đổi tính trạng còn chưa được nghiên cứu nhiều. Trong những năm gần đây, trên thế giới và ở Việt Nam các nhà sinh học đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá bộ gen của thực vật, trong đó có kỹ thuật phân tích đa dạng ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD).
A B
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể, nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền. Kết quả này đề cập đến ứng dụng của RAPD vào việc đánh giá hệ gen các dòng đậu tương chọn lọc bằng phương pháp chọn dòng biến dị soma, làm cơ sở cho việc chọn lọc những dòng có những đặc tính và tính trạng mong muốn.
3.2.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN từ lá của các dòng chọn lọc
Cây tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước của 2 giống ĐVN5 và ĐVN6 được chuyển ra ngoài đồng ruộng trong điều kiện canh tác bình thường. Trong tổng số 123 cây xanh, qua theo dõi chúng tôi thấy có 56 dòng cây sinh trưởng nhanh hơn giống gốc và các dòng khác. Trong đó chúng tôi lựa chọn một số dòng cây tiêu biểu làm đại diện để phân tích đa hình ADN bằng kỹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});