Ly trích DNA plasmid

B ngă3.1ăK tăq uă nhătínhăho tătínhăkhángăkhu nă aă áă hal onă ăv ng

2.2.4.Ly trích DNA plasmid

Nguyên t c:ăDoătrongăm tăt ă oăviăkhu nă ùngăl ă óă2ăh ăg nă ùngăt năt i ă óă

l ăh ăg nă a nh năt ă oăv ăh ăg nă aăplasmi ănênăvi ăph năl păv ătá hă hi tă DNAăplasmi ăl măsaoăkhôngăt păl năv iăDNAă aănh năt ă o.

Chu năb ăviăkhu năth ănghi m:

 Ph năl păviăkhu năE. coli mang plasmid pDG 1664 KS (+) trênă aăth hă LA có kháng sinh ampicillin 100 µg/ml.

 C yăkhu năl ăriêngăl ăv oă25ămlămôiătr ngăLB có kháng sinh ampicillin 100ăµg/ml ăl ăquaă êmă ă37o

C.

 Lyăt mă anhă yă4000ăvòng trong 15 phút, thu nlo iă ă hăn i.

 Pha n trong 4 ml GTE.ă ătrongă áă5ăph t.

 Thêm 4 ml NaOH- SDS.ăL ănh .ăHuy nă hăviăkhu nătr ănênătrong.ă ă trongă áă10- 15 phút.

 Thêm 4 ml KOA ă5M ăl ănh .ăK tăt aăs ă u tăhi n.ă ă ănhi tă ăph ngă 10 phút.

 Lyăt măl nhă13000ăvòng trong 10 phút.

 Thuă hă n i ă ă sungă nă tuy tă iă l nhă t ă l ă 1/2 5 ăDNA s ă t aă trongă thanol.ă 10ăph tă ănhi tă ăph ng.ăLyăt mă13000ăvòng trongă10ăph t ălo iă ă hă n i.

 R aă nv iă nă70ol nh.

 Ly tâm 13000 vòng trongă10ăph tălo iă ă năr aă n i.ă ăkhôăt ănhiên.

 Hòa ntrongă500ăµlă măTE0,1 ă oăqu nă-20 C.

2.2.5. Tinhăch ăplasmidă

Plasmi ăsauăkhiă ătá hă hi tăs ă ătinhă h ă ălo iă ăt p h tă ngă tăKită tinhă h ă aăProm ga.

Nguyên t c: Wizard® SV Gel and PCR Clean- UpăSyst mătá hă hi tăv ătinhăs hă

m nhăDNAăkho ngă100 păt iă10k ăt ăg lă agaros ă hu năho ăg lă óă i mănóngă h yăth pătrongă ă măTAEă(Tris- a tat )ăho ăTBEă(Tris- orat )ăv iăkh ăn ngă thuăh iă70- 95%. B ăkită aăv oăkh ăn ngăliênăk tă aăDNAăv iăm ngăsili aătrong h ă mă óăn ngă ămu iă aoăv ăs ă ngă ăm tăth pă(chaotropic salt).

G năDNA:

 Thêmă mă g nă trênă m ngă tă v oă hă plasmi ă tháoă o nă th oă t ă l ă 1:1 ă huy nălênăgi aăm ngă t ă ă1ăph tă ănhi tă ăph ng.ăLyăt mă13400ăvòng trong 1 ph t ă ă ă hă h yăquaă t.

R aălo iăt păch t:

 Thêmă700ăµlă măr aă óă thanolătuy tă iă(1:5)ălênă t.ăLyăt mă13400ăvòng trongă1ăph t ă ă ă hă h yăquaă t.

 Ti păt ăthêmă500ăµlă măr aă óă thanolătuy tă iă(1:5)ălênă t.ăLyăt mă 13400 vòng trongă5ăph t ă ă ă hă h yăquaă t.

Tách DNA:

 Chuy nă tăv oă pp n orfă1 5ămlăkhôngăn p.

 Thêm 50 µl 2dH2Oăti tătrùng.ă ă1ăph tă ănhi tă ăph ng.ăLy tâm 13400 vòng trong 1 phút.

 Gi ă hătrongă pp orfă1 5ămlăs hăkhá .

i nă iătrênăg lăagaros ă ăki mătraăk tăqu ătinhă h ăplasmi .

2.2.6. Th ănghi măho tătínhăDNA gyrase

Enzym gyrase óăkh ăn ngătháoă o nă ngă á hăg năv oăph năt ăDNA v ă tăm tă trongăhaiăm hă ătháo o n.ă (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

M tă năv ăho tătínhă nzym ă nhăngh aă ngăl ngăenzym ătá ă huy nă iă95%ă aă0,5ăµgăplasmi ăt ă ngătháoă o năsangă ngăsiêuă o năkhi có ATP ho ăng ăl iăkhiăkhôngă óăATP trongă30ăph tă ă37oC ă ăphátăhi nă ngă i nă di trên gel agarose.

 Th nghi m kh n ngtháo xo n c a DNA gyrase

- H năh păph nă ngă(30ăµl)ă h a:ă măDNA gyrase 1X, 0,5 µg plasmid p1664 KSă(+)ă ngăsiêuă o n ă ungă hă h tăkhángăkhu n ăDNA gyrase. M uă h ngăs ă khôngă óăm tă h tăkhángăkhu n.

- ă ă37oC trong 30 phút.

- D ngăph nă ngă ngă á hăthêmă3ăµlăprot as ăKă(1ămg/ml). - Ph nătí hăk tăqu ă ngă á hă i nă iătrênăg lăagaros .

 Th nghi m kh n ngsiêu xo nc a DNA gyrase

- H năh păph nă ngăt ngăt ănh ph nă ngătháoă o n ă ăsungăthêm 1,75 mM ATP, plasmid s ă ngă ngătháoă o n.

CH NG 3. K T QU VÀ BÀN LU N

3.1. NHăTệNHăKH ăN NGăKHÁNGăKHU N

Ti năh nhă nhătínhă á ă h tăth ă hal onă ăvòng: H1, H2, F2, T2, P1, N11, F12, F16 v ăoflo a inălênăhaiă h ngăMRSA ăMSSA.ăPh ngăphápăth ă ăti năh nhă nh ăm 2.2.2.

K tăqu ă nhătínhăs ă ă ă á ă nhă ngăvòng ă h ăs ăphátătri nă aăviă khu nătrênă ăm tăth h.

MRSA P1 F16 H1 T2 F2 DMSO N11 H2 F12 Of MSSA P1 F16 H1 T2 F2 N11 H2 F12 Of P1 H1 T2 F16 H2 N11 DMSO F12 F2 Of E. coli DMSO

Hình 3.1 K tăqu ăkhángăMRSA,ăMSSA và E. coli c aăcácăch tăth B ngă3.1 K tăqu ăđ nhătínhăho tătínhăkhángăkhu năc aăcácăchalconăd ăvòng

Ch tăth ngăkínhăvòngă căch ă(mm)

E. coli MRSA MSSA

P1 1,3 ± 0,1 9,0 ± 0,1 12,0 ± 0,1 H1 2,0 ± 0,1 11,0± 0,05 14,0 ± 0,05 H2 0,7 ± 0,05 5,0 ± 0,1 6,0 ± 0,1 F2 1,1 ± 0,1 4,0± 0,05 4,5 ± 0,05 F12 0,8 ± 0,1 6,0± 0,1 7,1 ± 0,1 F16 1,2 ± 0,1 7,0 ± 0,1 7,0 ± 0,1 T2 1,8 ± 0,1 8,0 ± 0,1 9,0 ± 0,1 N11 0 0 0 DMSO 0 0 0 Ofloxacin 31 ± 0,05 31 ± 0,05 30 ± 0,05

Nh n xét:

K tăqu ăkhángăkhu nă hoăth y các chalconă ăv ngă uă óăvùngă ă h ă iăv i E. coli, MRSA, MSSA.

Trongă ó ăH1, F16, T2 và P1 cóăho tătínhăt tătrênă ăMSSA ăMRSAăv iă ngă kính vùng ă h ăkho ngă7ă- 14 mm.ăCh tăF12, H2 ngă óă ngăkính vòng ă h ă n mătrongăkho ngă5ă- 7 mm. Còn F2 có vòng ă h ăm ăn mătrongăkho ngă4- 4,5 mm. V iăE. coli: H1, F16, F2, T2 và P1 ngăkínhă ă h ăv ngăkhángăkhu nănh h n ăn mătrongăkho ngă1 2- 2ămm ă h tăF12 ăH2ăkho ngă0,7- 0,8 mm.

Ch tăN11ăkhôngăkhángăMRSA ăMSSA ngănh ăE. coli nênă ă ùngănh ăl ă m tă h ngă mătrongăthíănghi mă ă h ăgyras .

iăv iăkhángăsinhăoflo a ină óăvòng khángăkhu năt ngă iăl năkho ngă31ămmă iăv iăMRSA, E. coli v ă29ămmă iăv i MSSA.

3.2. XÁCă NHă N NGă ă Că CH ă T Iă THI Uă C Aă CÁCă CH Tă

TH ăVẨăKHÁNGăSINH

Sauăkhiă nhătínhăs ă ăho tătínhăkhángăkhu nă aă á ă h tăth ăti năh nhă á ă nhăn ngă ă ă h ăt iăthi uă(MIC)ă aă á ă hal onă ăvòng v ă khángăsinhă iă h ngăoflo a in.ăCh ngă măl ăN11ăv ă h ng dung môi DMSO.ăCá ă h tăth ă ă phaălo ngă ăhaiăth nhă yăn ngă ă1024- 1 µg/ml.

DMSO N11 1024 E E MR MS MR MS

Hình 3.2 Th ănghi măMICăc aăch tăN11vƠăm uăđ iăch ngăDMSO

K tăqu ă hoăth yă ăm uă h ngă măN11ă(n ngă ă1024ă µg/ml)ăv ă h ngă ungă môiăDMSOăviăkhu năm ă nhăth ng ă h ngăt ă ungămôiăphaă h tăth ăkhôngă nhă h ngă năho tătínhăkhángăkhu nă aă h tăth .

16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 DMSO MR MS MR MS MR MS E E E

Hình 3.3 MICăc aăkhángăsinhăofloxacin

E: E. coli; MR: MRSA; MS: MSSA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Kháng sinh oflo a ină ă ă á ă nhă ă h ăkhángăkhu nănh ăkh ăn ngă ă h ă DNA gyras ă aăviăkhu n.ăGiáătr ăMICă aăkhángăsinhăs ă ngătrongă ăt iăl 0,5 µg/mlă iăv iă ă3 h ngăviăkhu năth ănghi măMRSA và MSSA và E. coli , so sánh v iăgiáătr ăMICă(trongă ngă i năgi iăkhángăsinhă aăCLSIăM100-S18ă(2008))ă aă h ngă viă khu nă nh yă mă oflo a ină l ă 1 g/ml ă th ă 3ă h ngă viă khu nă trongă th ă nghi mănh yă măv iăofloxacin. Nh v yăkhángă sinhă iă h ngă óăho tătínhă t t ă ăs ă ngăl mă h ngăsoăsánhăv iă á ă h tăth ănghi m.

64 32 16 8 1 2 4 DMSO F12 MR MS E E E E E E E E MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS E E E 64 32 16 8 4 2 1 DMSO E E E E E E E E E E MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS F2 E

Hình 3.4 MICăc aăchalconăF12,ăF2trênă3ăch ngăMRSA,ăMSSA và E. coli

1024 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 DMSO E E E E E E E E E E E MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS H2 1024 512 256 64 32 16 8 4 8 2 8 1 8 DMSO 128 MS MR E MS E MS MR E MS MR E MS MR P1 E E E MR E MS MR E E MR MS

Hình 3.5 MICăc aăchalconăH2,ăP1 trên 3ăch ngăMRSA,ăMSSAăvƠăE. coli

1024 512 256 128 32 16 64 8 4 2 1 DMSO E E E E E E E E E E E MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS H1 1024 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 DMSO E E E E E E E E E E MS MR MS MS MS MS MS MS MR MR MR MR MR T2

Hình 3.6 MICăc aăchalcon H1, T2 trên 3ăch ngăMRSA,ăMSSAăvƠăE. coli

1024 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 DMSO MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS MR MS E E E E E E E E E E F16 E

Hình 3.7 MICăc aăchalcon F16 trênă3ăch ngăMRSA,ăMSSAăvƠăE. coli

E: E. coli; MR: MRSA; MS: MSSA

B ngă3.2 K tăqu ăxácăđ nhăMICăc aăcácăch tăth

Ch tăth MIC (µg/ml)

E. coli MRSA MSSA

P1 512 64 32 H1 512 32 32 H2 1024 128 128 F2 1024 64 64 F12 1024 128 128 F16 1024 64 64 T2 512 32 64 N11 >1024 >1024 >1024 Ofloxacin 0,5 0,5 0,5 Nh n xét:

 MICă aăH1, P1, T2 là 32- 64 µg/ml iăv iăMRSA ăMSSA.

 Giáătr ăMICă aăF2 F16, H2, F12ă aoăh năH1 ăP1ăv ăn mătrongăkho ngă64- 128ăµg/mlă iăv iăMRSA ăMSSA.

 iă v iăE. coli giáă tr ă MICă aă á ă h tă th ă nghi mă kháă l nă n mă trongă kho ngă512- 1024 µg/ml.

iă h ngăoflo a inănh ngăv năth ăhi năho tătínhăkhángăkhu n.ăH năn a m ătiêuă aă ăt iăl ă á ă nhăho tătínhăkhángăkhu nă aă á ă hal onă ăvòng ă h ăkhôngă ph iăm ătiêu là thayăth ăkhángăsinh.

 So sánhăv i ngă i năgi iăkhángăsinhăM100-S18ă aăCLSIă(2008), H1, P1 và T2 óăgiáătr ăMIC iăv iăMRSA ăMSSA trongăkho ngăMIC aă á ăkhángăsinhă thu ănhómăcephalosporins (32-64 µg/ml) ăho á ă khángă sinhă ngău ngănh ă cefaclor, cefuroxime, cefprozil, loracarbef (MIC 32 µg/ml) iăv iăMRSA.ă

3.3. K TăQU ăTÁCHăCHI TăPLASMID

Ly trích DNA plasmi ăt viăkhu năE. coli mang plasmid pDG 1664 KS (+). K tă qu ătá hă hi tă ă i nă iăki mătraătrênăg lăagaros 1%.

ADNăplasmi ă ngătháoă o n ADNăplasmi ă ngăth ng ADNăplasmi ă ngăsiêuă o n

Hình 3.8 i nădiăplasmidătáchăchi tătrênăgelăagarose

Nh n xét:

K tăqu ătá hă hi tăplasmi ăthuă ă aă ngăplasmi : ngătháoă o n ă ngă th ngăv ă ngăsiêuă o nă(Hình 3.8).

Th ănghi măkh ăn ngă h ăDNA gyras ă năplasmi ă ă ngătháoă o nă( iă v iăph nă ngăsiêuă o n)ăv ăsiêuă o nă( iăv iăph nă ngătháoă o n).ăDoă óăchúng tôiăti năh nhătinhă h ă ăthu plasmi ă ă ngătháoă o nv ăsiêuă o n.

3.4. K TăQU ăTINHăS CHăPLASMID

ADNăplasmi ă ngătháoă o n ADNăplasmi ă ngăth ng ADNăplasmi ă ngăsiêuă o n

1 2 3

Hình 3.9 i nădiăplasmidătinhăs chătrênăgelăagarose (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

1: M uăplasmi ătr ăkhiătinhăs h.ă2:ăM uăplasmi ătháoă o nătinhăs h.ă3:ăM uă plasmi ăsiêuă o nătinhăs h

Nh n xét:

K tăqu ătinhăs hăplasmi ă ng 1 ă3:ăplasmi ă ă ngătháoă o nv ăsiêuă o năl mă nguyênăli uă hoăth ănghi măho tătínhătháoă o năv ăsiêuă o nă aăgyras .

K tăqu ăth ănghi măkh ăn ngă ă h ăDNA gyrase aă hal on

Doăgiáătr ăMICă aă á ă h tăth ăătrên E. coli l năh n soăv iăMRSA và MSSA nên h ngătôiăti năh nhăth ănghi măkh ăn ngă ă h ăDNA gyras ă aă á ă h tăth ăv iă n ngă ăgi mă năt ăgiáătr ăMICă aăE. coli năgiáătr ăMICă iăv iăMRSA.

Gyr - - 1024

Gyr +

Plasmi ătháoă o n Plasmi ăsiêuă o n

 K tăqu ăHình 3.10 hoăth yă h tăF2ăv năth ăhi nkh ăn ngă ă h ăgyras ă ă giáătr ăMICă iăv iăMRSAătrongăth ănghi măsiêuă o n.

 K tăqu ăt ngăt ă hoă á ă h tă hal onăkhá .ăV ăv yă h ngătôiăs ă ngăn ngă ă aă á ă h tă ngăgiáătr ăMICă iăv iăMRSAătrongă á ăth ănghi măti păth o.

3.5. K TăQU ăTH ăNGHI MăKH ăN NGă CăCH ăDNAăGYRASEă

C AăCHALCON

3.5.1. Th ănghi măho tătínhătháoăxo năc aăgyrase

Ti năh nhăth ănghi măkh ăn ngătháoă o năplasmi ă aăDNA gyras ătrongă mă khôngă óăATP ăk tăqu ăthuă ănh ăsau:

Gyr - - Of N11 H1 H2 F2 F12 F16 P1 T2 Gyr +

Plasmi ătháoă o n Plasmi ăsiêuă o n

Hình 3.11 Th ănghi măkh ăn ngătháoăxo năc aăgyraseă

Gyr: gyrase, Of: Ofloxacin, -: không có gyrase ho c không có ch t th Nh n xét:

 Gi ng gyrase âm không có gyrase và ch t th nên plasmid v n d ng siêu xo n.

 Gi ng gyras ă ng có gyrase khi không có ATP, plasmid chuy n t d ng siêu xo n sang tháo xo n.

 Ofloxacin có ho t tính kháng khu n c ch gyrase nên plasmid v n d ng siêu xo n.

 Các chalcon H1, H2, F2, F12, F16, P1, T2 có ho t tính kháng khu n. Plasmid v n d ng siêu xo n ănh ăv y các ch t này có kh n ngăkhángăkhu nănh ă ofloxacin.

 N11 không có ho t tính kháng khu n và ph n ng tháo xo n v n x y ra. Nh ăv y N11 không có kh n ngă c ch gyrase.

3.5.2. Th ănghi măho tătínhăsiêuăxo năc aăDNA gyrase

Ti năh nhăth ănghi măkh ăn ngăsiêuă o năplasmi ă aăDNA gyras ătrongă mă óă ATP ăk tăqu ăthuă ănh ăsau:

Plasmi ătháoă o n Plasmi ăsiêuă o n

Gyr - - Of N11 H1 H2 F2 F12 F16 P1 T2 Gyr +

Hình 3.12 Th ănghi măkh ăn ngsiêuăxo năc aăenzym gyrase

Gyr: gyrase, Of: Ofloxacin, -: không có gyrase ho c không có ch t th Nh n xét:

 Gi ng gyrase âm không có gyrase và ch t th nên plasmid v n d ng tháo xo n. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Gi ng gyras ă ngăcó m t gyrase khi có ATP, plasmid d ng tháo xo n tr thành d ng plasmid d ng siêu xo n.

 Ofloxacin có ho t tính kháng khu n thông qua vi c c ch gyrase nên plasmid v n d ng tháo xo n.

 Các chalcon H1, H2, F2, F12, F16, P1, T2 có ho t tính kháng khu n.

 Bên c nhă óă h ngătôiăti n hành gi m n ngă các ch t th nghi m xu ng giá tr ¾, 2/3, ½ MIC nh m so sánh kh n ngă c ch DNA gyrase so v i k t qu MIC trên. Plasmi ătháoă o n Plasmi ăsiêuă o n Gyr - Of H1 H2 F2 F12 F16 P1 T2 Gyr + 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Hình 3.13 Th ănghi măthayăđ iăn ngăđ ătácăđ ngăc aăch tăth ătrên gyrase

Gyr: gyrase ; Of: ofloxacin; , -: không có gyrase 1,2,3: n ngă ă hal onăl năl tăl ă¾, 2/3, ½ MIC

Nh n xét:

 Gi ng ch ng không có gyrase nên plamid v n d ng tháo xo n.

 Gi ng ch ngă ngă oflo a ină n ngă b ng ¾ MIC v n c ch c enzym gyrase nên plasmid v n d ng tháo xo n. Ofloxacin n ngă b ng 2/3, ½, MIC không c ch c enzym gyrase nên enzym v n ho tă ng và plasmid chuy n t d ng tháo xo n sang siêu xo n.

 Chalcon H1, F2, F16, P1, T2 n ngă b ng ¾, 2/3 MIC plasmid d ng tháo xo n do c ch c enzym gyrase. n ngă b ng ½ MIC không c ch

c enzym gyrase, plasmid chuy n t d ng tháo xo n sang siêu xo n.

 Chalcon H2, F12 do có ho t tính kháng khu n th păh n ă c ba n ngă ¾,

2/3, ½ MIC không còn kh n ngă c ch gyras ănênăthuă c plasmid d ng tháo xo n.

Bàn lu n

aă á ă h tăth ătrongăth ănghi mătínhăkhángăkhu n. H1, F2, F16, P1, T2 óăho tă tínhă khángă khu nă ngă2

/3 MIC ă ă th ă H1ă l ă 21ăµg/ml, F2, F16, P1, T2 là 42,6 µg/ml. N11ăkhôngă óăho tătínhăkhángăkhu nătrongă ăph nă ngă nhătínhăv ăkhôngă th ăhi năkh ăn ngăkhángăkhu nătrongăth ănghi măn y.ăDoă ó,ă h ngătôiă óăth ăs ă ă k tălu nă á ă h tăth ătrongă ăt iă óăkh ăn ngăkhángăkhu năthôngăquaăvi ă ă h ă ho tă ngă aă nzym DNA gyrase. H năn a ă á ă h tăn yătá ă ngălênăkh ăn ngă tháoă o năl năsiêuă o nă aă nzymăgyras .

Plap răv ă ngăs ăkhiănghiênă uătínhăkhángăkhu nă aăqu r tin ă ă h ngăminh qu r tinăth ăhi nătínhăkhángăkhu nă ngă á hă ă h ăDNA hayăv ătríăg năATPă aă gyrase [36].ăQu r tină ă h ăgyras ănênăplasmi ăv nă ătr ngătháiătháoă o nă ă á ă n ngă ăqu r itină1 3ă ă10-3

M, 5 x 10-4M, 2,5 x 10-4M ăt ngă ngăv iă á ăn ngă ă h tăth ă hal on ăH1 ă h ăgyras ăth ăhi nătrongă ăt iăn yăl năl tăl ă0 875 x 10-

4M , F2, F16, P1, T2 kho ngă1,78 x 10-4M;ăk tăqu ăn yă ngăt ngăt ănh ănghiênă uă aăGra isarăv ă ngăs ăv iăn ngă ă h tăth ă at hinătrongătr ă anhă ă h ă gyrase là 1 x 10-4M [20].ă i uăn yă h ngăt cá ă h tăth ăthu ăh ă hal on kháng khu nă ngă á hătá ă ngă ă h ăgyras ă óăth ă nănhi uă nă h tăchalcon khác h aă ănghiênă uă ngă óătínhăn ngăkhángăkhu nă ă h ă nzymăgyras ă aăviă khu n.

Trongănghiênă uă h ngătôiă ngănh năth yă iăv iăE. coli ăgiáătr ăMICă aă á ă h tăth ănghi mă aoăh năkho ngă20ăl năsoăv iăn ngă ă ă h ăDNA gyrase trong