Kết quả nghiên cứu thực nghiệm

II.1. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm

Với mục tiêu tìm hiểu thông tin methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gene RECK bằng phương pháp Methylation-specific-PCR (MSP), chúng tôi phải thực hiện các quy trình thực nghiệm:

− Quy trình tách chiết DNA thích hợp từ một số mẫu bệnh phẩm: mẫu sinh thiết mô của các bệnh nhân ung thư vú (mẫu mô lành, mẫu mô bệnh); mẫu DNA tách chiết từ mẫu máu hoặc dịch phết tế bào âm đạo (kèm các chỉ tiêu lâm sàng) được xác định nhiễm Human papilloma virus kiểu gene độc và lành do công ty Việt Á cung cấp.

− Quy trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit ZymoResearch. − Quy trình MSP nhằm phát hiện sự methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter

2.1.1. Kết quả tách chiết DNA

Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm: mẫu sinh thiết mô của các bệnh nhân có bệnh ung thư vú hoặc các bệnh lý khác về vú; mẫu dịch phết tế bào âm đạo (kèm các chỉ tiêu lâm sàng) được xác định nhiễm Human papilloma virus kiểu gen độc và lành. Phương pháp tách chiết DNA bằng cách sử dụng xylene đối với mẫu mô đúc paraffin, xử lý màng tế bào và màng nhân bằng chất tẩy mạnh (SDS 10%) và proteinase K phenol. Sau đó, chúng tôi sử dụng phenol/chloroform biến tính protein và thu tủa DNA bộ gen người. Trước khi thực hiện phản ứng biến đổi DNA bằng bisulfite, chúng tôi kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 260 và 280 nm với độ pha loãng 80 lần. Kết quả đo OD của các mẫu đại diện trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5: Kết quả đo OD

Mẫu ung thư vú Mẫu lành của bệnh

nhân ung thư vú

Mẫu ung thư cổ tử cung

Mẫu Nồng độ Mẫu Nồng độ Mẫu Nồng độ

B4 39.5914 BP4 39.8756 C4 40.205

B5 40.2327 BP5 39.6183 C5 39.9301

Kết quả nêu trên cho thấy phương pháp tách chiết phenol/chloroform phù hợp đối với việc tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm. Sau khi tách chiết, các mẫu có nồng độ DNA khá cao, chất lượng và độ tinh sạch của DNA cũng đạt giới hạn khá tốt (A260/A280 nằm trong khoảng 1,6 đến 1,8).

2.1.2. Thực hiện phản ứng MSP sử dụng DNA bệnh phẩm

Chúng tôi tiến hành pha loãng các mẫu DNA ly trích từ bệnh phẩm, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 25µl với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như mô tả ở bảng 2.1 và hình 2.2. Nguồn mẫu DNA thuộc các mẫu DNA ly trích từ các mẫu bệnh phẩm ung thư vú và ung thư cổ tử cung và đã được biến đổi bisultie từ, các

43 mẫu bệnh phẩm này đã xác định có sự methyl hóa trên một số gen khác: BRCA1, CCDN1, CCND2,…). Tuy nhiên, chúng tôi không thu được kết quả như mong đợi (dữ liệu không trình bày) với lượng DNA trong khoảng 6,135 ng. Sau đó chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng PCR (2 cặp mồi MF-MR; UF-UR) với lượng DNA tăng lên 10 lần (khoảng 61,35 ng).

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.8: Kết quả điện di mẫu B2

Nhằm tăng tính hiệu quả của phản ứng MSP với bộ mồi methyl và unmethyl, chúng tôi tiến hành thử nghiệm một số điều kiện tối ưu: nhiệt độ lai. Thử nghiệm khảo sát nhiệt độ lai tối ưu cho 2 cặp mồi MF-MR và UF-UR trong dãy nhiệt độ: 52oC, 52.7oC, 53.9oC, 55.7oC, 58.1oC, 60oC, 61.2oC, 62oC. Kết quả điện di lô sản phẩm MSP đối với cặp mồi methyl (MR-MF) và unmethyl (UR-UF) của gen RECK ở tất cả 8 nhiệt độ lai nêu trên được trình bày ở hình 3.9 và 3.10. Kết quả điện di lô sản phẩm MSP của cặp mồi methyl (MR-MF) (Hình 3.9, 3.10) và unmethyl (UR-UF) (dữ liệu không trình bày) của gen

RECK cho thấy có sự hiện diện của vạch sản phẩm đúng như mong đợi 195 bp, nhiệt độ 60oC cho sản phẩm khuếch đại có cường độ tốt nhất so với dãy nhiệt độ còn lại. Do vậy, chúng tôi quyết định sử dụng nhiệt độ lai 60oC để tiếp tục thực hiện phản ứng MSP trên một số mẫu bệnh phẩm khác.

M: thang 100bp , giếng 1-8: N 61.2

Hình 3.9: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ tr

Giếng 1-8: Nhiệt độ: 62oC, 61.2

giếng 9: Chứng (

Hình 3.10: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ tr

II.2. Thử nghiệm MSP trên các m

cung

Chúng tôi thực hiện phả DNA bệnh phẩm với cặp mồi đ

Do điều kiện khách quan nên chúng tôi ch bệnh nhân ung thư vú và 3 mẫ

minh họa kết quả điện di sản ph cho gen RECK trên mẫu bệnh ph

8: Nhiệt độ: 52oC, 52.7oC, 53.9oC, 55.7oC, 58.1 61.2oC, 62oC, giếng 9: Chứng (-).

ết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B1

C, 61.2oC, 60oC, 58.1oC, 55.7oC, 53.9oC, 52.7 ếng 9: Chứng (-), M: Thang 100bp

ết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B2

ên các mẫu DNA bệnh phẩm ung thư vú và ung thư c

ản ứng MSP để khảo sát mức độ methyl hóa c i đặc hiệu, khuếch đại cho vùng khảo sát của gen n khách quan nên chúng tôi chỉ thực nghiệm trên 5 mẫu b

ẫu lành của bệnh nhân ung thư vú. Hình 3.8, 3.11, 3.12, 3.13 n phẩm MSP khuếch đại từ bộ mồi methyl- unmethyl đ

nh phẩm ung thư vú. 44 C, 58.1oC, 60oC, ẫu B1 C, 52.7oC, 52oC ẫu B2 ư vú và ung thư cổ tử

methyl hóa của các mẫu a gen RECK. u bệnh phẩm của ình 3.8, 3.11, 3.12, 3.13 unmethyl đặc hiệu

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.11: Kết quả điện di mẫu B3

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.12: Kết quả điện di mẫu B4, B5, B6

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

46 Kết quả khảo sát trên 8 mẫu bệnh phẩm B1-B8 (mẫu sinh thiết mô vú từ các bệnh nhân mắc ung thư vú, mẫu lành từ bệnh nhân mắc bệnh lý khác) được thể hiện ở hình: 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.112, dữ liệu trình bày ở bảng 3.6 cho thấy 5/5 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư vú (mẫu B1, B2, B3, B4, B8) cho kết quả methyl hóa gen RECK

dương tính đạt tỷ lệ 100%. Tuy nhiên, với cỡ mẫu nhỏ nên chúng tôi không tiến hành phân tích mối tương quan giữa mức độ methyl hóa trên gen RECK với các chỉ số lâm sàng (độ tuổi, phân độ mô học,…). Hơn nữa, 3 mẫu (mẫu B5, B6, B7) chúng tôi chưa thực hiện thành công việc khuếch đại với cặp mồi MF-MR và cặp mồi UF-UR, nguyên nhân có thể là do thao tác trong quá trình thực hiện phản ứng MSP. Kết quả khảo sát trên 3 mẫu bệnh phẩm B5, B6, B7 (mẫu sinh thiết mô vú lành của các bệnh nhân có bệnh lý khác về vú, không phải mắc bệnh ung thư vú) (hình 3.12, 3.13).

Chúng tôi sử dụng phần mềm MedCalc (2003) phân tích sơ bộ mối tương quan giữa sự methyl hóa vùng promoter gen RECK trên tổng số mẫu ung thư vú và mẫu lành (8 mẫu), kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa khoảng 62.5% (p< 0.05). Đây là một ghi nhận ban đầu về sự methyl hóa gen RECK đối với bệnh ung thư vú ở Việt Nam.

Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sự methyl hóa gen RECK trên 15 mẫu dịch phết tế bào âm đạo được xác định nhiễm Human papilloma virus (HPV) kiểu gen độc (nguy cơ cao) và nguy cơ thấp và mẫu lành hoặc không nhiễm HPV. Kết quả điện di sản phẩm MSP thể hiện qua hình 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18.

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.15: Kết quả điện di mẫu: C3, C4, C5, C6

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.16: Kết quả điện di mẫu C9

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR

Hình 3.18: Kết quả điện di mẫu C13, C14, C15, C16, C17

Kết quả khảo sát trên mẫu DNA được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm (máu, dịch phết âm đạo) được xác định có nhiễm HPV kiểu gen độc cho thấy: C1, C4, C5, C9, C10, C11, C13, C14, C17 cho kết quả dương tính với cặp mồi methyl MF-MR; Trường hợp mẫu C12 cho kết quả dương tính với cặp mồi methyl MF-MR, cặp mồi unmethyl UF-UR.

Trong tổng số 6 mẫu bệnh phẩm có nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cơ cao: 16, 18, 58..), 5/6 (83%) mẫu cho kết quả dương tính với cặp mồi methyl hóa gen RECK. Đối với 5 mẫu bệnh phẩm không nhiễm HPV, 1/5 (25%) mẫu cho kết quả dương tính với cặp mồi methyl hóa gen RECK (dữ liệu trình bày ở bảng 3.7)

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối với 6 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 3 mẫu u sợi tuyến

Ký hiệu

mẫu Tuổi Chẩn đoán

Kết quả methyl gen

RECK

B1 30 Ung thư vú methyl B2 35 Ung thư vú methyl B3 56 Ung thư vú methyl B4 53 Ung thư vú methyl B8 47 Ung thư vú methyl B5 31 U sợi tuyến nd B6 38 U sợi tuyến nd B7 18 U sợi tuyến nd

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối với 15 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm nhiễm HPV

Ký hiệu mẫu Tuổi Xét nghiệm Kết quả xét nghiệm

Kết quả methyl gen RECK C1 35 HPV-Geno (-) methyl C2 29 HPV-Geno (-) nd C3 27 HPV-Geno (-) nd C4 45 HPV-Geno (-) methyl C5 33 HPV-Geno (-) methyl C6 31 HPV-Geno Nguy cơ thấp nd C9 28 HPV-Geno Nguy cơ thấp methyl C10 33 HPV-Geno Nguy cơ thấp methyl C11 30 HPV-Geno Nguy cơ thấp methyl C12 33 HPV-Geno Nguy cơ cao methyl C13 33 HPV-Geno Nguy cơ cao methyl C14 48 HPV-Geno Nguy cơ cao methyl C15 36 HPV-Geno Nguy cơ cao nd C16 1987 HPV-Geno Nguy cơ cao methyl C17 1958 HPV-Geno Nguy cơ cao methyl

Đối với trường hợp không khuếch đại thành công với cặp mồi MF-MR, UF-UR ở các mẫu: C2, C3, C6, C7, C8, C15 do điều kiện khách quan nên hiện nay chúng tôi chưa thực hiện lại phản ứng MSP đối với các mẫu nêu trên.

Một kết quả ghi nhận về tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK đối với các mẫu bệnh phẩm mắc bệnh ung thư vú và các mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cơ cao) trong khoảng tỷ lệ: 60%-83%, phù hợp với kết quả khảo sát tỷ lệ methyl trên gen

RECK trên thế giới (hình 3.2)

Một đặc điểm chung có thể nhận thấy đối với những mẫu bệnh phẩm nêu trên (bệnh phẩm ung thư vú, bệnh phẩm ung thư cổ tử cung): B5, B6, B7, C3, C6, C7, C8, C15 đều không được khuếch đại bởi cặp mồi MF-MR (có thể là mẫu DNA không bị

50 methyl hóa trên gen RECK); hơn nữa toàn bộ các mẫu bệnh phẩm nêu trên đều không khuếch đại bởi cặp mồi UF-UR. Một điểm đáng lưu ý có thể là do cặp mồi UF-UR không hoạt động tốt, chúng tôi phải chú ý, phân tích về tính đặc hiệu cũng như thông số vật lý của cặp mồi UF-UR đối với các mẫu bệnh phẩm ở Việt Nam. Mặc dù là điểm hạn chế trong đề tài nhưng đây là kinh nghiệm và vấn đề đặt ra cho nhóm nghiên cứu chúng tôi cần tiếp tục tìm hiểu và phải hoàn thiện quy trình MSP trên gen RECK phụ thuộc vào nguồn mẫu bệnh phẩm (thuộc những chẩn đoán lâm sàng: sinh thiết mô vú..) từ các bệnh viện nhằm xác định chi tiết mối tương quan của sự methyl hóa trên gen RECK đối với bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

II.3. Giải trình tự mẫu đại diện:

Sau khi thực hiện phản ứng MSP, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu trên từng mạch riêng biệt với mồi xuôi và ngược methyl của gen RECK. Kết quả giải trình tự cho thấy sản phẩm MSP gen RECK đặc hiệu, hình 3.19 minh họa một kết quả điển hình sản phẩm giải trình tự gen RECK, sử dụng mồi ngược methyl.

Kết quả giải trình tự thu được trên mồi ngược methyl từ sản phẩm MSP bị methyl hóa của gen RECK trên mẫu bệnh phẩm B2, cho thấy vùng cuối của trình tự này xuất hiện chính xác trình tự bổ sung của mồi xuôi methyl. Như vậy, vị trí CpG trên mồi ngược methyl đều bị methyl hóa. Bên cạnh đó, vùng trình tự nằm giữa mồi cho kết quả trùng khớp, 7 vị trí CpG trong vùng gen khảo sát đều cho kết quả methyl hóa. Đồng thời, kết quả giải trình tự này còn cho phép chúng tôi khẳng định quá trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite thực hiện trước đó đã thành công.

Hình 3.19: Kết quả giải trình tự

(a)Vùng trình tư RECK chưa biến đổi bisulfite; (b) Vùng trình tự RECK biến đổi bisulfite; (c) Trình tự thu được từ giải trình tự với cặp mồi methyl (MF-MR); Vùng1, vùng 2: vị trí các CpG nằm trong vùng khảo sát, vùng 3: vị trí CpG nằmg

trong mồi xuôi methyl và 1 CpG nằm trong vùng khảo sát; Vùng chữ màu đỏ: trình tự gắn của mồi xuôi methyl MF; Chữ màu xanh: CpG

Chương IV

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận

Qua quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học cấp sinh viên, chúng tôi thu nhận một số kết quả quan trọng như sau:

1. Khai thác dữ liệu:

Thu thập dữ liệu về mức độ methyl hóa trên các đảo CpG thuộc vùng promoter gen RECK đối với một số bệnh ung thư: bệnh ung thư vú (tỷ lệ 57,1%.) [53] và ung thư cổ tử (chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào công bố về tỷ lệ methyl hóa gene RECK trên bệnh này).

2. Khảo sát in silico

Thu thập và xác định các thông số vật lý của bộ mồi (MF-MR; UF-UR) của hai nhóm tác giả M.Pesta và cộng sự (2009) và Changsong Zhang và cộng sự (2012) phù hợp với phương pháp MSP nhằm khảo sát mức độ methyl hóa các đảo CpG vùng promoter gen RECK trong một số bệnh ung thư như ung thư vú và ung thư cổ tử cung

3. Thực hiện nội dung nghiên cứu thực nghiệm:

Tiến hành quy trình tách chiết và biến đổi bisulfide DNA từ các nguồn mẫu sinh thiết mô của các bệnh nhân ung thư vú (mẫu mô lành, mẫu mô bệnh); mẫu DNA tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm máu của các bệnh nhân được xác định nhiễm HPV type lành và/hoặc không nhiễm HPV.

Xác định nhiệt độ lai tối ưu ở 600C cho bộ mồi (MF-MR; UF-UR) khuếch đại đặc hiệu trên vùng promoter gen RECK, kích thước sản phẩm khuếch đại đối với cặp mồi methyl (MF-MR) là 195bp, đối với cặp unmethyl (UF-UR) là 197bp.

Tiến hành xác định mức độ methyl hóa đối với 3 mẫu mô lành và 5 mẫu mô bệnh ung thư vú, 6 mẫu DNA của bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cơ cao (type 16, 18...), 4 mẫu DNA của bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cơ thấp, 5 mẫu DNA của bệnh nhân không nhiễm HPV. Một kết quả ghi nhận về tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK

đối với các mẫu bệnh phẩm mắc bệnh ung thư vú và các mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cơ cao) trong khoảng tỷ lệ: 60%-83%.

53 Đồng thời, chúng tôi phân tích sơ bộ mức độ methyl hóa trên gen RECK đối với bệnh ung thư vú thông qua phần mềm MedCalc (MedCal, 2003), ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK trên tổng số mẫu ung thư vú và mẫu lành (8 mẫu) khoảng 62.5% (p< 0.05).

II. Đề nghị

- Một điểm đáng lưu ý trong nghiên cứu này là tính hiệu quả của cặp mồi UF-UR chưa bộc lộ tốt trong một số mẫu. Do vậy, nếu có điều kiện chúng tôi cần phân tích nhằm xác định lại cặp mồi UF-UR phù hợp (điều trỉnh trình tự,…) với phương pháp MSP trong việc khảo sát sự methyl. Từ đó, chúng tôi hoàn thiện việc thực hiện xây dựng quy trình phản ứng PCR xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK trong ung thư.

- Chúng tôi mong muốn được tiếp tục thực hiện và phát triển nghiên cứu này nhằm có được số liệu methyl hóa trên gen RECK đối với mẫu bệnh phẩm ung thư vú và ung thư

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU