đây là phương pháp cho hiệu quả nhanh và chắnh xác nhất (phân biệt ựược thể lưỡng bội, tam bội và tứ bội). Tuy nhiên phương pháp này tốn kém.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 17
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. địa ựiểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu
2.1.1. địa ựiểm nghiên cứu
Phòng Di truyền và Chọn giống, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I. địa chỉ: đình Bảng Ờ Từ Sơn Ờ Bắc Ninh.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ 04/2012 ựến 03/2013.
2.1.3. đối tượng nghiên cứu
Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus).
2.1.4.Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
− Kắch dục tố (KDT): HCG.
− Xô, vợt, bát nhựa, lông gà, cốc ựong, khăn. − Tủ sốc nhiệt.
− Hệ thống khay ấp trứng, giai ương. − Lam, kim tiêm, pipet.
− Máy ảnh, kắnh hiển vi.
− Hóa chất nhuộm tế bào máu (Dung dịch Giemsa).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác ựịnh liều lượng KDT phù hợp
Bước 1: Tuyển chọn cá bố mẹ
Lựa chọn những con cá có khối lượng 500 Ờ 800 g/con, ngoại hình cân ựối, màu sắc tươi sáng và ựã thành thục: cá cái có lỗ sinh dục lồi, có màu hồng nhạt; cá ựực có màu sắc sặc sỡ và có sẹ màu trắng trong khi vuốt nhẹ phần lỗ sinh dục.
Bước 2: Xác ựịnh liều lượng KDT phù hợp
Cá bố mẹ sau khi ựược tuyển chọn ựưa vào bể (nhốt riêng ựực, cái) và thử nghiệm tiêm KDT cho cá cái ở các liều lượng khác nhau. Cụ thể:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 18 + Liều lượng: 2500, 3000 và 3500 UI/kg cá cái.
+ Vị trắ tiêm: Gốc vây ngực.
+ Mỗi công thức thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần, 15 con/công thức và tiêm 1 lần
Các công thức thắ nghiệm như sau:
+ Công thức 1 (CT1): HCG 2500 UI/kg cá cái. + Công thức 2 (CT2): HCG 3000 UI/kg cá cái. + Công thức 3 (CT3): HCG 3500 UI/kg cá cái . + Công thức 4 (CT4): Không tiêm (ựối chứng).
Sau 15 giờ kể từ khi tiêm KDT tiến hành theo dõi, kiểm tra ựể xác ựịnh thời gian hiệu ứng thuốc và tỷ lệ cá ựẻ làm cơ sở ựể chọn lựa liều lượng KDT phù hợp cho kắch thắch sinh sản nhân tạo cá rô phi vằn.
Sau khi tiêm kắch dục tố, với mỗi ựợt làm thắ nghiệm, hàng ngày theo dỗi yếu tố môi trường (8h và 14h) nhằm xác ựịnh ảnh hưởng của yếu tố môi trường tới hiệu quả tiêm. Kết quả thể hiện cuối cùng là trung bình cả 3 ựợt thắ nghiệm.
2.2.2. Xác ựịnh nhiệt ựộ và thời lượng sốc nhiệt nóng
Sau khi tiêm KDT, cá bố mẹựược nhốt riêng, ựến thời ựiểm cá cái rụng trứng thì tiến hành vuốt trứng và sẹựồng thời ựể thụ tinh nhân tạo. Trộn ựều tất cả trứng ựã thụ tinh và chia ra các lô thắ nghiệm sốc nhiệt và ựối chứng.
Phương pháp tạo thểựa bội bằng sốc nhiệt nóng cho trứng cá ựã thụ tinh: + Nhiệt ựộ sốc: 400C và 420C.
+ Thời gian sốc: 65 phút sau khi thụ tinh. + Thời lượng sốc: 3 phút và 5 phút. + Số trứng ựem sốc: 10 ml/lô thắ nghiệm. + Thắ nghiệm lặp lại 3 lần.
Tỷ lệ nở, tỷ lệ ra bột, tỷ lệ sống, tỷ lệ dị hình và tỷ lệựa bội ựược theo dõi là cơ sở cho việc lựa chọn thời ựiểm và thời lượng sốc nhiệt phù hợp ựể tạo cá rô phi ựa bội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 19
Với mỗi ựợt làm thắ nghiệm, hàng ngày các yếu tố môi trường nước trong quá trình ấp trứng ựược theo dõi thường xuyên, trường (8h và 14h) nhằm xác ựịnh ảnh hưởng của yếu tố môi trường tới hiệu quả tiêm. Kết quả thể hiện cuối cùng là trung bình cả 3 ựợt thắ nghiệm.
2.3. Phương pháp chăm sóc và quản lý
2.3.1. Ấp trứng
Trứng sau khi xử lý sốc nhiệt nóng ựược chuyển vào khay ấp có hệ thống nước lọc tuần hoàn theo quy trình của Viện nghiên cứu NTTS 1.
Trong quá trình ấp trứng cần kiểm tra, theo dõi thường xuyên nhằm ựảm bảo trứng ựược ựảo ựều và vệ sinh cặn bẩn trong khay.
2.3.2. Ương cá
Sau khi cá nở và hết noãn hoàng sẽ ựếm toàn bộ cá bột trong khay ựể xác ựịnh tỷ lệ ra bột của cá. Số cá bột này sẽ ựược chuyển ra ương trong giai theo quy trình của Viện 1.
2.4. Phương pháp thu thập số liệu
2.4.1. Xác ựịnh một số chỉ tiêu
Xác ựịnh số lượng trứng ựem sốc nhiệt nóng theo công thức:
N = a ừ V Trong ựó: a: số trứng ựã thụ tinh trong 1 ml
V: thể tắch trứng thắ nghiệm (10 ml) Số cá cái ựẻ trứng Tỷ lệ cá ựẻ (%) = --- ừ 100 Số cá cái kắch thắch cho ựẻ Số cá bột mới nở Tỷ lệ nở (%) = --- ừ 100 Số trứng thụ tinh Số cá ra bột Tỷ lệ ra bột (%) = --- ừ 100 Tổng số cá nở
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 Số cá thu ựược Tỷ lệ sống (%) = --- ừ 100 Tổng số cá thả ban ựầu Số cá dị hình Tỷ lệ dị hình (%) = --- ừ 100 Tổng số cá nở Số cá ựa bội Tỷ lệựa bội (%) = --- ừ 100 Tổng số cá kiểm tra 2.4.2. Xác ựịnh thể ựa bội
Sử dụng phương pháp ựo kắch thước nhân tế bào hồng cầu (Beck, Bigger 1983). đo chiều dài và chiều rộng nhân tế bào hồng cầu của cá ở lô ựối chứng và lô sốc nhiệt, sau ựó xác ựịnh thể tắch nhân tế bào hồng cầu theo công thức:
V = 4πab2/3 (ϻm3)
Trong ựó: a: nửa trục chắnh (ϻm) b: nửa trục phụ (ϻm)
Khi cá ựạt khối lượng 40 Ờ 50 g/con thì tiến hành thu mẫu máu của 30 con cá ngẫu nhiên/lô thắ nghiệm và nhuộm mẫu bằng dung dịch Giemsa Azurr Eozin Methylen theo phương pháp của Romanopxki, dùng kắnh hiển vi ựo kắch thước tế bào hồng cầu (Nhỏ dung dịch Giemsa lên tiêu bản. Sau 30-60 phút rửa tiêu bản bằng nước cất). Soi tiêu bản khô trên kắnh hiển vi ựộ phóng ựại 40X ựểựo kắch thước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
nhân tế bào hồng cầu xác ựịnh thể ựa bội (ựo ngẫu nhiên kắch thước của 30 tế bào hồng cầu /mẫu).
Cá thểựa bội (3n hoặc 4n) ựược xác ựịnh là những cá thể có thể tắch trung bình của nhân tế bào hồng cầu lớn hơn hoặc bằng 1,5 lần so với thể tắch trung bình của nhân tế bào hồng cầu ở các lô ựối chứng (2n) (Jonhson et al., 1984; Chourrout et al.,1986; Quillet, Gaignon, 1990; Child, Watkins, 1994).
2.5. Phân tắch và xử lý số liệu
Số liệu ựược thu thập, xử lý thống kê mô tả và phân tắch trên phần mềm excel. Các số liệu là tỷ lệ phần trăm ựược chuyển ựổi (arcos) về dạng phân phối chuẩn trước khi ựưa vào phân tắch. Phần mềm SPSS 17.0, so sánh Turkey với mức ý nghĩa P < 0,05 ựược sử dụng ựể phân tắch số liệu.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
PHẦN 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu liều lượng KDT
Bảng 3.1: Một số yếu tố môi trường trong bể cá bố mẹ
Nhiệt ựộ (0C) DO (mg O2/L) pH 25 Ờ 28 4 Ờ 4,3 7,1 Ờ 7,6
Một số thông số môi trường nước trong bể cá bố mẹ sau khi tiêm KDT thể hiện ở bảng 4.1 và ựều nằm trong ngưỡng thắch hợp cho các hoạt ựộng sinh lý diễn ra bình thường. Do ựó sẽ không có ảnh hưởng xấu tới hiệu quả KDT khi tiêm nhằm kắch thắch sinh sản cho cá rô phi vằn.
Bảng 3.2: Kết quả sử dụng kắch dục tố trên cá rô phi
Thời gian hiệu ứng (giờ) Liều lượng tiêm HCG/kg cá cái Tỷ lệ cá ựẻ (%) Bắt ựầu Kết thúc Trung bình ổ SE 2500 UI 23,33 ổ 4,41b 32 36 33,67 ổ 0,58a 3000 UI 61,11 ổ 3,36a 25 31 27,89 ổ 0,95b 3500 UI 65,56 ổ 4,98a 17 20 18,44 ổ 0,48c Không tiêm 6,67 ổ 1,67c - - -
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có ký tự mũ (a, b, c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P <0,05). SE là sai số chuẩn.
Kết quả sử dụng KDT cho thấy ở các công thức thắ nghiệm cao hơn lô ựối chứng. Tỷ lệ cá ựẻựạt kết quả cao nhất khi tiêm HCG ở nồng ựộ 3000 UI/kg cá cái và 3500 UI/kg cá cái lần lượt là 65,56% và 61,11 %, tuy nhiên sự sai khác giữa 2 công thức này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Thời gian hiệu ứng nhanh nhất là 17giờ (trung bình 18,44 giờ) tương ứng khi tiêm HCG ở nồng ựộ tiêm 3500UI/kg cá cái, sau ựó là 3000 UI/kg cá cái (trung bình 27,89 giờ) và cuối cùng là 2500 UI/kg cá cái (trung bình 33,67 giờ) (P<0,05).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Như vậy, kết quả cho thấy sử dụng kắch dục tố HCG với liều lượng 3000 Ờ 3500 UI/kg cá cái là phù hợp ựể kắch thắch sinh sản nhằm thu sản phẩm sinh dục phục vụ thắ nghiệm tạo ựa bội thể ựối với cá rô phi vằn; thời gian hiệu ứng thuốc khi sử dụng HCG với liều lượng tốt nhất từ 17 ựến 31 giờ. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Garcia-Abiado và ctv (1994), cũng như của El-Hakim và ctv (2005) thử nghiệm tiêm HCG trên cá rô phi cho thấy ở liều lượng tiêm 2500 Ờ 3500 UI/kg cá cái cho tỷ lệựẻ ựạt từ 36 Ờ 85%, thời gian hiệu ứng 24 giờ. Nhận thấy hiệu quả sử dụng HCG cho tỷ lệựẻ của cá cái trong nghiên cứu này là chưa cao so với các loài cá khác. Nguyên nhân, có thể do ựộ thành thục của cá rô phi tuyển chọn làm cá bố mẹ không tương ựồng (cá rô phi sinh sản nhiều lần trong năm nên trong buồng trứng cá cái luôn có trứng phát triển ở nhiều giai ựoạn).
3.2. Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu thắ nghiệm sốc nhiệt
Thử nghiệm sốc nhiệt cho trứng ở 2 mức nhiệt ựộ 400C và 420C, thời gian sốc là 65 phút sau khi trứng ựược thụ tinh, thời lượng sốc là 3 phút và 5 phút.
Bảng 3.3: Một số yếu tố môi trường nước trong quá trình ấp trứng
Nhiệt ựộ (0C)
DO
(mg O2/L H2O) pH
25 - 28 4,0 Ờ 4,4 7,0 Ờ 7,5
Kết quả theo dõi một số yếu tố môi trường nước ấp trứng cá rô phi vằn của thắ nghiệm cho thấy ựây là ựiều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cá rô phi. Vì vậy ựiều kiện môi trường nước trong quá trình thắ nghiệm sốc nhiệt thuận lợi cho các thắ nghiệm sốc nhiệt.
Kết quả vềảnh hưởng của nhiệt ựộ và thời lượng sốc nhiệt ựến một số chỉ tiêu sinh sản ựược trình bày ở bảng 3.4.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và thời lượng sốc nhiệt ựến một số chỉ tiêu sinh sản Nhiệt ựộ sốc (0C) Thời lượng sốc (phút) Tỷ lệ nở (%) Tỷ lệ ra bột (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ dị hình (%) 3 18,65 ổ 1,70c 34,26 ổ 2,19c,d 42,30 ổ 1,45c 1,96 40 5 17,33 ổ 2,50c,d 34,01 ổ 1,20c,d 36,20 ổ 0,08d 3,57 3 31,56 ổ 0,02b 41,94 ổ 0,01b 54,39 ổ 0,05b 0,74 42 5 13,58 ổ 0, 02d 33,77 ổ 0,03d 35,84 ổ 0,04d 1,34 đối chứng 52,81 ổ 0,04a 66,47 ổ 0,03a 72,13 ổ 0,01a 0,04
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có ký tự mũ (a, b, c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
3.2.1. Tỷ lệ nở
Hình 3.1: Ảnh hưởng của sốc nhiệt tới tỷ lệ nở
Kết quả nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của sốc nhiệt nóng cho trứng cá rô phi vằn ựã thụ tinh. Tỷ lệ nở của trứng cá rô phi vằn ở lô ựối chứng cao hơn các lô sốc nhiệt. Tỷ lệ nở của lô ựối chứng ựạt 52,81%; trong khi ựó các lô sốc nhiệt nóng tỷ lệ nở cao nhất cũng chỉ ựạt 31,56% khi sốc ở 420C, thời ựiểm sốc 65 phút sau khi thụ tinh, thời lượng sốc 3 phút.
3.2.2. Tỷ lệ ra cá ra bột
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, tỷ lệ ra cá bột của lô ựối chứng cao hơn các lô sốc nhiệt (P<0,05). Trong các lô sốc nhiệt, khi sốc nhiệt ở 420C, thời ựiểm sốc 65 phút sau thụ tinh, thời lượng sốc 3 phút cho tỷ lệ ra ca bột cao nhất (ựạt 41,94%), tỷ lệ nởở các lô còn lại không có sai khác ý nghĩa thống kê (P>0,05).
3.2.3. Tỷ lệ sống
Hình 3.3: Ảnh hưởng của sốc nhiệt tới tỷ lệ sống
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ sống của cá rô phi vằn ở lô ựối chứng cao hơn các lô thắ nghiệm (P<0,05). Nguyên nhân do thểựa bội thường yếu hơn thể lưỡng bội trong giai ựoạn phát triển phôi cũng như giai ựoạn từ cá bột lên cá hương (Thorgaard, 1986; Nguyễn Tường Anh, 1999). Tỷ lệ sống ở lô ựối chứng cao nhất ựạt 72,13%; tiếp ựến là ở lô thắ nghiệm khi sốc nhiệt ở 420C, thời ựiểm sốc 65 phút sau thụ tinh, thời lượng sốc 3 phút cho tỷ lệ sống ựạt 54,39%; thấp nhất là ở hai lô thắ nghiệm khi sốc nhiệt ở 400C và 420C, thời ựiểm sốc 65 phút sau thụ tinh, thời lượng sốc 5 phút, sự sai khác giữa hai công thức này không có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
3.2.4. Tỷ lệ dị hình
Kết quả nghiên cứu thu ựược số cá dị hình còn sống sót cho tới thời ựiểm kiểm tra lấy mẫu rất ắt so với tổng số cá thu ựược. Thực tế số cá dị hình có thể lớn hơn rất nhiều nhưng ựã bị chết từ trước khi mẫu ựược kiểm ựếm.
Tỷ lệ dị hình là chỉ tiêu quan trọng ựánh giá ảnh hưởng của sốc nhiệt tới cá rô phi vằn. Tuy nhiên qua kết quả nghiên cứu của ựề tài chưa ựủ kết luận kết quả về thểựa bội bị dị hình hay kết quả của sốc nhiệt nóng.
3.3. Kết quả sốc nhiệt tạo cá rô phi ựa bội
Kết quả kiểm tra kắch thước nhân tế bào hồng cầu và tỷ lệ ựa bội trong mỗi lô thắ nghiệm ựược trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 3.5: Kết quả thắ nghiệm tạo ựa bội thể bằng sốc nhiệt nóng Thể tắch nhân tế bào hồng cầu (ộm3) Nhiệt ựộ (0C) Thời lượng (phút) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Tỷ lệựa bội (%) 3 9,35 15,86 11,27 ổ 0,35a,b 20,65 ổ 2,55b 40 5 8,75 16,83 10,95 ổ 0,95b 18,58 ổ 1,33b